S6实验六植物茎尖的培养理论.docx
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S6实验六植物茎尖的培养理论
实验六植物茎尖培养(理论)
病毒对寄主植物可造成毁灭性危害,导致大幅度减产,甚至全株死亡。
潜隐性病毒侵染植物造成症状不明显的慢性危害,不易被发现,尤其危险。
国内外解决作物病虫害的有效途径是培育无病毒苗,实施农作物无病毒化栽培。
所谓“无病毒苗”,是指不含该种植物的主要危害病毒,即经检测主要病毒在植物内的存在表现阴性反应的苗木。
因此,培育无病毒母株,是获得无病毒苗的根本途径。
一、病毒在植物体内的分布及危害
1、病毒在植物体内的分布
病毒侵染植物叶片后即增殖并向附近细胞转移,尽管速度很慢,但经过一段时间,叶片内病毒浓度达到一定量而到达韧皮部。
1943年,White首先发现已感染的烟草植株生长点附近烟草花叶病毒浓度很低,甚至没有。
1948—1949年,Holmes和Masset等证实了病毒的分布随植株不同部位和年龄而异。
★老叶和成熟的组织中病毒含量高
★幼嫩和未成熟的组织及器官中病毒含量较低
★根尖、茎尖点约0.1~1mm区域中几乎不含病毒
病毒的传播:
筛管组织、胞间连丝、营养体及刀具、土壤
茎尖分生组织无分化,没有维管组织。
2、病毒的危害
已发现的植物病毒超过500种,草莓病毒曾使日本草莓的产量严重下降,品质退化。
★病毒危害极大
★不能通过化学杀菌和抗生素进行防治和消除
★研究脱毒方法意义重大
二、植物脱毒的意义
1、能够有效地保持优良品种的特性
任何一种优良品种均需要有一个忠实地保存其遗传性状的繁殖方法。
离体无性繁殖:
不会造成性状分离、不会产生退化、避免病虫害的侵染
2、快速繁殖品种,使优良品种迅速应用
离体繁殖周期短(1~3个月)、不受季节限制、繁殖系数高
3、生产无病毒种苗,防止品种退化
目前受病毒危害严重影响生产的有:
大田作物:
马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草
蔬菜:
白菜、大蒜、葱、番茄、箩卜
果树:
柑橘、苹果、草莓、香蕉
花卉:
香石竹、各种菊花、天竺葵、紫罗兰
4、节约耕地,提高农产品的商品率
块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物,每年产品用留作种的比例:
大蒜:
留种量占产量的五到八分之一;
马铃薯:
留种量占产量的十分之一;
贝母:
留种量占产量的三分之一。
5、便于运输
常规的块根、块茎等,体细胞大、含水量高,包装运输十分不便,远距离运输损失很大
离体繁殖的种苗体积小,一般自带容器,很易携带,运输十分方便
以马铃薯为例子:
按一亩地4000株计算,常规薯4000个重200kg(每个50g),若用试管薯4000个则只有2kg(每个0.5g)。
三、植物脱毒的原理和方法
(一)热处理脱毒法
1、热处理脱毒原理
病毒DNA分子进入细胞后随植物细胞的DNA一起复制。
热处理并不能杀死病毒,只能钝化病毒的活性,使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止,而失去传染能力。
2、热处理方法
(1)愈伤组织热处理
离体培养愈伤组织热处理继代分化培养。
常用处理温度及时间:
低温37—38℃处理2周、4周或8周;或高温50℃处理3—5min。
(2)热空气处理脱毒法
将试验母株放在高温生长室中生长一阶段,使其顶端分生组织比次生分生组织生长迅速,然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。
生长室温度35—40℃。
光照3000—10000lx。
3、热处理的局限性
(1)并非所有的病毒都对热处理敏感。
一般的热的处理只对等径的、线状的病毒和类菌质体起作用。
(2)延长热处理时间,病毒钝化效果好,同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。
(3)热处理后只有一小部分植株能够存活。
(二)组织培养脱毒法
包括微茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、珠心组织培养脱毒3种方法。
1、微茎尖培养脱毒法
由于其脱毒效果好,后代遗传稳定,是目前植物无病毒苗培育上使用最广泛的一种方法。
(1)原理及依据
a、病毒在植物体内分布不均匀,越接近顶端分生组织,病毒浓度越稀,因此,可以采用小茎尖的离体培养脱除植物病毒。
b、病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争,在迅速合成的植物细胞中正常合成的蛋白质占优势。
(2)操作程序
外植体经表面消毒灭菌后,在解剖镜下,经无菌操作切取小茎尖,接种到备用培养基上,放入培养室内进行培养,并及时观察和记录培养结果。
2、愈伤组织培养脱毒法
(1)原理及依据
a、病毒在植物体内不同器官或组织分布不均匀;
b、病毒复制的能力衰退或丢失;
c、继代培养的愈伤组织产生抗性变异。
(2)技术关键
诱导可再生出植株的愈伤组织。
(3)操作程序
植物各种器官或组织诱导产生出愈伤组织,愈伤组织多次继代,然后从愈伤组织再诱导分化芽,长成植株。
愈伤组织培养脱毒法脱毒效果不定,另外经由愈伤组织产生的植株可能出现一些变异,这些变异往往是人们不希望出现的,这种脱毒的方法使用的不多。
3、珠心组织培养脱毒法
病毒是通过维管组织传播的,而珠心组织和维管束系统无直接联系,故可以通过珠心组织离体培养获得无病毒植株。
(三)微体嫁接离体培养脱毒法
这种方法是把极小的茎尖作为接穗嫁接到实生砧木上,然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。
接穗在砧木的饲喂下很容易成活。
由于微体嫁接的接穗是很小的茎尖,微茎尖的带毒几率很小,故采用微体嫁接的方法可以获得无毒苗。
微嫁接要求的剥离技术很高,嫁接成活率与接穗大小呈正相关,而脱毒率与接穗大小呈负相关。
四、植物脱毒苗的鉴定
1、视觉观察法看植株茎叶是否有该病毒所有可见症状。
2、生物鉴定法利用摩擦接种,把待测的植物液汁接种在敏感植物上,然后视其有无病斑,来判断是否脱除了病毒;也可以采用嫁接鉴定法来鉴定。
3、电子显微镜鉴定法用电子显微镜直接观察经脱毒培养的叶片,检查是否有病毒粒子存在,还可以测量病毒颗粒的大小、形状和结构。
4、抗血清鉴定法利用抗原与抗体特异反应的特性,用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒的种类,其中酶联免役吸附反应(ELISA)是常用的一种方法。
5、分光光度法即把病毒的纯品干燥、称重,配成已知浓度的病毒悬浮液,在260nm下测其光密度,并折算成消光系数。
利用分光广度法测得的病毒浓度是指全部核蛋白的浓度。
五、无病毒原种的保存、应用及繁殖
获得无毒原种不易,如果保存不好会很快重新感染病毒,为防止再度感染,应在隔离的条件下保存。
如果原种保存得好,无毒原种可以利用5—10年,在生产上可以创造更多的经济效益。
1、隔离种植保存
通过无毒原种要在隔离区或隔虫网室内种植保存。
无毒原种即使种植在隔离区,仍有可能被重新感染,因此还要定期进行重感病毒的检测,一旦发现隔离区内有感病毒时,应采取相应措施排除病毒再次传播。
2、离体保存
脱毒苗经鉴定后,选择无病原种株系,回接于试管内,可长期保存,是最理想的保存方法。
3、无毒原种的应用
获得无毒原种后,一方面要积极进行无毒苗的推广,另一方面还要做好无病毒种的繁育。
无毒苗的推广应在发展良种的新区使用才能取得良好的效果;在老病区使用时应实行统一的防治措施,一次性全区换种,才能取得应有的效果。
4、无病毒原种的繁殖
可在无毒源和其他病虫害的大田中进行,场地土壤要进行消毒,防治蚜虫、线虫和其他传毒媒介,并建立一套严格的原种繁育制度和栽培管理制度,防止病毒的再次感染。
八、离体繁殖的使用范围
加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物。
加速繁殖的特殊基因型,如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等。
用于自然繁殖极易感染病毒的植物,如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等。
用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无性繁殖的植物,如非洲菊、花竹、紫罗兰等。
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