检验技术文档格式.docx
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4.4在进行性状检验时,如果发现个别瓶有霉菌生长,可废弃有霉菌者,再从该批无可见霉菌生长的其他瓶中抽取样品20瓶,置25~30℃,观察1个月,如果无霉菌生长,或仅1瓶有霉菌生长,产品出厂前,再逐瓶肉眼检验1次,废弃有霉菌生长的疫苗,其余可出厂。
如果有2瓶以上有霉菌生长时,则该批制品应判为不合格。
4.5矿物油佐剂疫苗的黏度应不超过200cP。
5、无菌检验或纯粹检验用培养基:
T.G、G.A、G.P、适于本菌或本病毒生长的培养基
6、安检用药的剂量应多大?
安检用药的剂量应大于使用剂量。
活疫苗的安检用剂量是使用剂量的10倍以上,灭活疫苗的安检用剂量是使用剂量的2倍以上。
7、效力检验的影响因素有哪些?
免疫原性、免疫保护的持续期、抗原的稳定性、抗原量
8、效力检验的方法有哪些?
攻毒保护试验、病毒含量测定、血清学试验、其它方法如测定体温等。
9、血清学实验方法有哪些?
红细胞凝集(HA)抑制(HI)试验、中和试验(SN)、酶联免疫实验(ELISA)等。
10、支原体检验使用什么培养基?
整个检验移植几次?
多长时间?
阳性会出现什么变化?
改良Frey培养基(液体和固体);
4次;
从第一次接种后共28天。
培养基有颜色变化和菌落生长为合格。
11、外源病毒检验有几种方法?
3种;
⑴鸡胚检查法;
⑵鸡检查法;
⑶细胞检查法。
鉴别检验(活疫苗)
12、鉴别检验的目的:
确认检品是本疫苗抗原,避免产品发生混淆。
13、冻干疫苗的剩余水分含量最高是多少?
4℅。
14、检验冻干疫苗真空度使用什么仪器?
怎样为合格?
高频火花真空测定器;
开启高频火花真空测定器使之指向瓶中无制品的部位,以出现粉色或白色辉光者为合格。
15、病原性鉴定使用的动物?
主要针对那类菌?
怎样判定合格?
小白鼠和豚鼠;
需氧菌检查和厌氧菌检查;
观察10天,以全部健活,无局部化脓、坏死现象为合格。
病毒半数致死量、感染量
(LD50、ELD50、ID50、EID50、TCID50)测定法
将病毒悬液作10倍系列稀释,取适宜稀释度,定量接种实验动物、胚或细胞。
由最高稀释度开始接种,每个稀释度接种4~6只(枚、管、瓶、孔),观察记录实验动物、胚或细胞的死亡数或病变情况,计算各稀释度死亡或出现病变的实验动物(胚、细胞)的百分率。
按Reed-Muench法计算半数致死(感染)量(LD50、ELD50、ID50、EID50、TCID50)。
计算公或为:
lgTCID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×
稀释系数的对数
表试验示例(以TCID50为例,接种量为0.1ml)
病毒稀释度
观察结果
累计结果
CPE数
无CPE数
CPE(%)
10-4
6
100
13
10-5
5
1
83
7
88
10-6
2
4
33
29
10-7
11
10倍系列稀释的稀释系数的对数为-1。
高于50%感染时(上例中为88%),病毒稀释度(10-5)的对数值为-5。
lgTCID50=-5+0.64×
(-1)=-5.64
则:
TCID50=10-5.64/0.1ml。
表示该病毒悬液作10-5.64稀释后,每孔(瓶)细胞接种0.1m1,
可以使50%的细胞产生细胞病变(CPE)。
红细胞凝集试验法
150孔板或试管法
按下表用PBS(0.1mol/L,pH7.0~7.2,下同)将被检品稀释成不同的倍数,加入1%鸡红细胞悬液,置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟,当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果,以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
表红细胞凝集试验术式
单位:
ml
孔或管号
3
8……
对照
样品稀释倍数
10
20
40
80
160
320
640
1280
PBS
0.9
0.5
}↘
}↘弃0.5
样品(病毒原液)
0.1
-
1%鸡红细胞悬液
296孔微量板法
2.1在微量板上,从第1孔至12孔或所需之倍数孔,用移液器每孔加入PBS0.025ml,用移液器吸取被检样品0.025ml,从第1孔起,依次作2倍系列稀释,至最后一个孔,弃去移液器内0.025ml液体(稀释倍数依次为2、4、8、16、32……4096)。
2.2每孔加入1%鸡红细胞悬液0.025ml,并设不加样品的红细胞对照组,立即在微量板振摇器上摇匀,置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟,当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。
2.3以使红细胞完全凝集的最高稀释液作为判定终点。
红细胞凝集抑制试验法
1血凝素工作液配制
1.1血凝素凝集价测定50孔板或试管法按表1,96孔微量板法按表2术式进行。
用
PBS(0.1mol/L,pH值7.0~7.2,下同)将血凝素稀释成不同倍数,加入与抑制试验中血清量等量的PBS,再加入1%鸡红细胞悬液。
将50孔板或试管前后左右摇匀,将96孔微量板在振摇器上摇匀,置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟,当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。
以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
1.2血凝素工作液配制及检验
1.2.14HAU血凝素的配制如果血凝素凝集价测定结果为1:
1024(举例),4个血凝单位(即4HAU)=1024/4=256(即1:
256)。
取PBS9.0ml,加血凝素1.0ml,即成1:
10稀释,将1:
10稀释液1.0ml加入到24.6mlPBS中,使最终浓度为1:
256。
1.2.2检验检查4HAU的血凝价是否准确,应将配制的1:
256稀释液分别以1.0ml
的量加入PBSl.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml和6.0ml中,使最终稀释度为1:
2、1:
3、1:
4、1:
5、1:
6和1:
7。
然后,从每一稀释度中取0.25ml,加入PBS0.25ml,再加入1%鸡红细胞悬液0.25ml,混匀。
加果用微量板,方式相同。
即从每一稀释度中取0.025ml,加入PBS0.025ml,再加入1%鸡红细胞悬液0.025ml,混匀。
将血凝板置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟,如果配制的抗原液为4HAU,则1:
4稀释度将给出凝集终点;
如果4HAU高于4个单位,可能1:
5或1:
6为终点;
如果较低,可能1:
2或1:
3为终点。
应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整,使工作液确为4HAU。
表1血凝素凝集价测定(50孔板或试管法)术式
ml
血凝素稀释倍数
10
40
640
0.4
0.25
}↘弃0.25
血凝素
表2血凝素凝集价测定(96孔微量板法)术式
孔号
稀释倍数
8
16
32
64
128
256
0.025
}↘弃0.025
0.025
2血凝抑制试验(HI)
2.150孔板法或试管法按表3用PBS将本血清做2倍系列稀释,加入含4HAU的血凝素液,并设PBS和血凝素对照,充分振摇后,置室温下至少20分钟或在2~8℃下至少60分钟,再加入1%鸡红细胞悬液,置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟,当红细胞对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。
以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。
2.296孔微量板法与50孔板法方式相同,各成分量及加样顺序见表4。
表3血凝抑制试验(50孔板或试管法)术式
7……
病毒对照
红细胞对照
}↘弃0.25
本血清
4HAU抗原
表4微量血凝抑制试验(96孔板或试管法)术式
单位:
孔号
0.025
0.05
}↘弃0.025
0.025
附注:
1%鸡红细胞悬液的标定
对首次配制的鸡红细胞悬液应进行标定。
取配好的红细胞悬液(附录14页)60ml,自然沉淀后,弃掉上部PBS50ml,混匀后装入刻度离心管内,以10000r/min离心5分钟,红细胞压积应为6.0%。
红细胞悬液制备法
11%鸡红细胞悬液的配制采取2~4只2~6月龄SPF鸡的血液,与等量阿氏液混合,
然后用PBS(0.1mol/L,pH值7.0~7.2,下同)洗涤3~4次,每次以1500r/min离心5~10分钟,将沉积的红细胞用PBS配制成l%悬液。
2豚鼠红细胞悬液的配制采取豚鼠血液,与阿氏液等量混合,用乳依液或乳汉液PBS反复洗涤3次,每次以1500r/min离心10分钟,最后将沉积的红细胞配成0.5%红细胞悬液。
3绵羊红细胞悬液的配制采取公绵羊血液,脱纤后,用PBS洗涤3次,每次以2000r/min离心10分钟,最后取沉积的红细胞,配成2.5%或2.8%红细胞悬液。
甲醛残留量测定法
本法仅适用于不含酚红的产品。
1对照品溶液的制备取已标定的甲醛溶液适量,配成每1.0ml含甲醛1.0mg的溶液,精密量取5.0ml置50ml量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。
如果被测样品为油乳剂疫苗,则精密量取上述稀释溶液5.0ml置50ml量瓶中,加20%吐温-80乙醇溶液l0ml,再加水至刻度,摇匀,即得。
2供试品溶液的制备
2.1油乳剂疫苗用5.0ml刻度吸管量取被检品5.0ml,置50ml量瓶中,用20%吐温-80乙醇溶液l0ml,分次洗涤吸管,洗液并入50ml量瓶中,摇匀,加水稀释至刻度,强烈振摇,静止分层,下层液如果不澄清,滤过,弃去初滤液,取澄清续滤液,即得。
2.2其他疫苗用5.0ml刻度吸管量取本品5.0ml,置50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,溶液如果不澄清,滤过,弃去初滤液,取澄清续滤液,即得。
3测定法精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5ml,分别加醋酸-醋酸铵缓冲液
10ml,乙酰丙酮试液l0ml,置60℃恒温水浴15分钟,冷水冷却5分钟,放置20分钟后,按紫外-可见分光光度法(《中国兽药典》一部附录26页),在4l0nm的波长处测定吸收度,
计算即得。
附注:
1醋酸-醋酸铵缓冲液(pH值6.25)的配制
醋酸液取醋酸(AR)12.9ml,加水至l00ml。
醋酸铵液取醋酸铵(AR)173.4g,加水至l000ml,使溶解。
取醋酸液40ml,与醋酸铵液l000ml混合,置冷暗处保存。
2乙酰丙酮试液的配制取乙酰丙酮(AR)7.0ml,加乙醇14ml混合,加水至l000ml。
3甲醛溶液含量标定取甲醛溶液约1.5ml,精密称定,置锥形瓶中,加水l0ml,与溴麝香草酚蓝指示液2滴,滴加氢氧化钠滴定液(1.0mol/L)至溶液呈蓝色,加过氧化氢试液25ml,再精密加入氢氧化钠滴定液(1.0mol/L)25ml,瓶口置一玻璃小漏斗,在水浴上加热15分钟,不时振摇,冷却,用水洗涤漏斗,加溴麝香草酚蓝指示液2滴,用盐酸滴定液(l.0mol/L)滴定至溶液显黄色,并将滴定结果用空白试验校正。
每1.0ml的氢氧化钠滴定液(1.0mol/L)相当于30.03mg的甲醛。
黏度测定法
黏度系指流体对流动的阻抗能力,本法以动力黏度或运动黏度数表示。
流体分牛顿流体和非牛顿流体两类。
牛顿流体流动时所需剪应力不随流速的改变而改变,纯液体和低分子物质的溶液属于此类;
非牛顿流体流动时所需剪应力随流速的改变而改变,高聚物的溶液、混悬液、乳剂和表面活性剂的溶液属于此类。
黏度的测定用黏度计。
黏度计有多种类型,本法采用毛细管式和旋转式两类黏度计。
毛细管黏度计因不能调节线速度,不便测定非牛顿流体的黏度,但对高聚物的稀薄溶液或低黏度液体的黏度测定较方便;
旋转式黏度计一般适用于非牛顿流体的黏度测定。
液体以1.0cm/s的速度流动时,在每1.0cm2平面上所需剪应力的大小,称为动力黏度(η),以Pa·
s为单位。
在相同温度下,液体的动力黏度与其密度(kg/m3)的比值,再乘10-6.0,即得该液体的运动黏度(ν),以mm2/s为单位。
本法采用在规定条件下测定供试品在平氏黏度计中的流出时间(s),与该黏度计用已知黏度的标准液测得的黏度计常数(mm2/s2)相乘,即得供试品的运动黏度。
本法测定所需仪器用具:
恒温水浴可选用直径30cm以上、高40cm以上的玻璃缸或有机玻璃缸,附有电动搅拌器与电热装置,除另有规定外,在20℃±
0.1℃测定运动黏度或动力黏度。
温度计分度为0.1℃。
秒表分度为0.2秒。
平氏黏度计(如图1)可根据需要分别选用毛细管内径为0.8±
0.05mm、1.0±
0.05mm、1.2±
0.05mm、1.5±
0.1mm或2.0±
0.1mm的平氏黏度计。
旋转式黏度计
第一法(用平氏黏度计测定运动黏度或动力黏度)照各品种项下的规定,取毛细管内径符合要求的平氏黏度计1支,在支管F上连接一橡皮管,用手指堵住管口2,倒置黏度计,将管口1插入供试品(或供试品溶液,下同)中,自橡皮管的另一端抽气,使供试品充满球C与A并达到测定线m2处,提出黏度计并迅速倒转,抹去黏附于管外的供试品,取下橡皮管使连接于管口1上,将黏度计垂直固定于恒温水
浴中,并使水浴的液面高于球C的中部,置15分钟后,自橡皮管的另一端抽气,使供试品充满球A并超过测定线m1,打开橡皮管口,使供试品在管内自然下落,用秒表准确记录液面自测定线m1下降至测定线m2处的流出时间。
依法重复测定3次以上,每次测定值与平均值的差值不得超过平均值±
5%。
另取一份供试品同样操作,并重复测定3次以上。
以先后两次取样测得总评均值按下式计算,即为供试品的运动黏度或供试品溶液的动力黏度。
ν=Kt
η=l0—6·
Kt·
ρ
式中K——用已知黏度的标准液测得的黏度计常数,mm2/s2;
t——测得的平均流出时间,s;
ρ——供试溶液在相同温度下的密度,kg/m3。
第二法(用旋转式黏度计测定动力黏度)用于测定液体动力黏度旋转式黏度计,通常都是根据在旋转过程中作用于液体介质中的切应力大小来完成测定的,并按下式计算供试品的动力黏度。
η=K(T/ω)
式中K——用已知黏度的标准液测得的旋转式黏度计常数;
T——扭力矩;
ω——角速度。
常用的旋转式黏度计有以下几种:
(1)同轴双筒黏度计将供试品注入同轴的内筒和外筒之间,并各自转动,当一个筒以指定的角速度或扭力矩转动时,测定对另一个圆筒上产生的扭力矩或角速度,由此可计算出供试品的黏度。
(2)单筒转动黏度计在单筒类型的黏度计中,将单筒浸入供试品溶液中,并以一定的角速度转动,测量作用在圆筒表面上的扭力矩来计算黏度。
(3)锥板型黏度计在锥板型黏度计中,供试品注入锥体和平板之间,锥体和平板可同轴转动,测量作用在锥体或平板上的扭力矩或角速度以计算黏度。
(4)转子型旋转黏度计按品种项下的规定选择合适的转子浸入供试品溶液中,使转子以一定的角速度旋转,测量作用在转子上的扭力矩再计算黏度。
常用的旋转式黏度计有多种类型,可根据供试品的实际情况和黏度范围适当选用。
按照各检验品种项下规定选用所需使用的仪器,并按照仪器说明书操作,测定供试品的动力黏度。
剩余水分测定法
采用真空烘干法。
测定前,先将洗净干燥的称量瓶置150℃干燥箱烘干2小时,放入有无水氯化钙的干燥器中冷却后称重。
迅速打开真空良好的疫苗瓶,将制品倒人称量瓶内盖好,
在天平上称重。
每批做4个样品,每个样品的重量为100~300mg,称后立即将称量瓶置于有五氧化二磷的真空干燥箱中,打开瓶盖,关闭真空干燥箱后,抽真空至2.67kPa(20mmHg)以下,加热至60~70℃,干燥3小时。
然后通入经过氯化钙吸水的干燥空气,待真空干燥箱温度稍下降后,打开箱门,迅速盖好称量瓶的盖,取出所有称量瓶,移入无水氯化钙干燥器中,冷却至室温,称重,放回真空干燥箱继续干燥1小时,两次干燥至恒重,减失的重量即为含水量。
外源病毒检验法
1样品处理取样品2~3瓶。
对毒种或活疫苗进行检验时,将样品混合,用相应的特异性抗血清中和后作为检品(另有规定除外);
对细胞进行检验时,经3次冻融后混合作为检品;
用鸡检查法检验时,样品不处理。
如果对检品中的病毒中和不完全,可用效价更高的血清重做,或用制品使用对象进行检验。
2禽源细胞及其制品和其他禽源制品的检验通常情况下,采用鸡胚检查法和细胞检查法进行,如果检验无结果或结果可疑时,用鸡检查法进行检验。
2.1鸡胚检查法
2.1.1选9~11日龄SPF鸡胚20个,分成2组,第1组10枚鸡胚,经尿囊腔内接种0.1~0.2ml(如果为疫苗,至少含10羽份),第2组10枚鸡胚,经绒毛尿囊膜接种0.1~0.2ml(如果为疫苗,至少含10羽份),置37℃下培养7日。
弃去接种后24小时内死亡的鸡胚,但每组鸡胚应至少存活8只,试验方可成立。
2.1.2判定胎儿应发育正常,绒毛尿囊膜应无病变。
取鸡胚液作血凝试验,应为阴性。
2.2细胞检查法
2.2.1细胞观察取2个已长成良好鸡胚成纤维细胞单层的(培养24小时左右)细胞培养瓶(面积不小于25cm2),接种中和后的疫苗0.2m1(2~20羽份),培养5~7日,观察细胞,应不出现CPE。
2.2.2红细胞吸附试验取上述培养的细胞,弃去培养液,用PBS洗涤细胞面3次,加入0.1%(V/V)鸡红细胞悬液覆盖细胞面,置2~8℃60分钟后,用PBS轻轻洗涤细胞1~2次,在显微镜下检查红细胞吸附情况。
应不出现由外源病毒所致的红细胞吸附现象。
2.2.3禽淋巴白血病病毒检验COFAL试验或ELISA试验见附录30页。
2.2.4禽网状内皮组织增生症病毒检验间接免疫荧光试验(IFA)见附录32页。
2.3鸡检查法用适于接种本疫苗日龄的SPF鸡20只,每只同时点
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