组织工程医疗器械产品海藻酸钠.docx
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组织工程医疗器械产品海藻酸钠
组织工程医疗器械产品海藻酸钠
1 范围
本标准规定了海藻酸钠作为原料的要求、试验方法、检验规则、标志、包装等。
本标准适用于制备组织工程医疗器械产品及其支架材料的海藻酸钠。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T191包装储运图示标志
GB/T2828.1计数抽样检验程序第1部分:
按接收质量限(AQL)检索的逐批检验抽样计划
GB/T16886.1 医疗器械生物学评价第1部分:
风险管理过程中的评价与试验
YY/T0313医用高分子产品包装和制造商提供信息的要求
《中华人民共和国药典》(2015版)
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
分解decomposition
由于暴露在环境中,化学的或热的因素导致海藻酸钠结构的改变,例如温度高于180℃。
分解作用可导致海藻酸钠产生毒性变化。
3.2
降解degradation
材料的化学结构、物理性质或外观发生改变。
聚合物的降解通常依靠酸催化水解,断裂糖苷键来实现,在受热时也常会发生降解。
降解不是分解。
对聚合物而言,降解通常是指解聚。
3.3
解聚depolymerization
聚合物链的长度缩小成为较短的链段。
解聚可以将聚合物变为寡糖和/或单糖单元。
对海藻酸钠而言,糖苷键的水解是解聚的首要因素。
3.4
水合胶体hydrocolloid
当水合时水溶性聚合物形成的胶体。
3.5
平均分子量averagemolecularmass(averagemolecularweight)
平均分子量最常用的表达方式是数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw),其计算公式如下:
Mn=∑NiMi/∑Ni
Mw=∑wiMi/∑wi=∑NiMi2/∑NiMi
式中:
Ni——具有特定分子量Mi的分子数量;
Wi——具有特定分子量Mi的分子质量;
在一个多分散体系中,Mw>Mn。
Mw/Mn即分子量分布数值,海藻酸钠的Mw/Mn通常在1.0~3.0之间。
4 要求
4.1性状
应为白色或淡黄色粉末状固体。
4.2鉴别
通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)检测且其典型特征峰(cm-1)基本一致:
3375~3390(b),1613(s),1416(s),1320(w),1050~1125(b),903(m),600~710(b)。
其中,s:
强带;m:
中级带;w:
弱带;b:
宽带。
4.3结构组成
采用1H-核磁共振光谱(NMR)检测,典型1H-NMR谱显示如下:
图1
4.4平均分子量及其分子量分布
应确定海藻酸钠的平均分子量及其允差范围,以及分子量分布数值。
注:
推荐海藻酸钠的分子量分布数值为1.0~3.0之间。
4.5干燥失重
应不大于15.0%(质量分数)。
4.6灰分
应为18.0%~27.0%(质量分数)。
4.7重金属含量
以铅计重金属总量应不大于0.004%(质量分数),其中砷含量应不大于0.00015%(质量分数),铅含量应不大于0.001%(质量分数)。
4.8蛋白质含量
应不大于0.3%(质量分数)。
4.9细菌内毒素
应小于0.5EU/mg。
4.10微生物限度
细菌菌落总数应不大于200CFU/g。
4.11生物学评价
对本材料在预期使用中与人体接触的部位、性质和时间进行分类,按照GB/T16886.1所述的基本原则进行生物安全性评价。
5 试验方法
5.1性状
目视观察,应符合4.1的规定。
5.2鉴别
通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测定(溴化钾压片法),应符合4.2的规定。
5.3结构组成
采用1H-核磁共振光谱(NMR)检测,试验方法见附录A,应符合4.3的规定。
5.4平均分子量及其分子量分布
平均分子量可通过以下两种方法来确定:
特性黏数法,以及凝胶渗透色谱联合多角度激光散射测定仪(SEC-MALLS)测定分子量。
试验方法见附录B,应符合4.4的规定。
5.5干燥失重
采用《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0831规定的方法测定。
应符合4.5的规定。
5.6灰分
按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0841的方法测定,推荐在800℃下灼烧至少6h。
应符合4.6的规定。
5.7重金属含量
重金属总量按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0821重金属检查法第二法测定,砷含量按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0822砷盐检查法第一法测定,铅含量按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0406原子吸收分光光度法第一法测定,应符合4.7的规定。
注:
砷含量、铅含量也可按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0412电感耦合等离子体质谱法测定。
5.8蛋白质含量
按照附录C规定的方法测定,应符合4.8的规定。
5.9细菌内毒素
按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则1143规定的方法进行测定。
应符合4.9的规定。
5.10微生物限度
按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则1105规定的方法测定,应符合4.10的规定。
5.11生物学评价
按照GB/T16886.1所述的基本原则进行生物安全性评价。
6 检验规则
6.1批检验
6.1.1 产品以同日投料,同一工艺生产的产品为同一批号。
6.1.2 批检验应进行4.1,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,4.10的检测。
6.2型式检验
6.1.3 型式检验为全性能检验。
6.1.4 型式检验时,若所有检验项目全部合格,则判定为合格,否则判定为不合格。
6.3抽样检验
抽样方案按照GB/T2828.1进行。
7 标志
7.1 大包装应有下列标志:
a)生产厂名和地址;
b)产品名称;
c)产品注册号和执行标准编号;
d)分类和规格;
e)生产批号或日期;
f)失效日期;
g)贮存条件。
7.2 小包装应有下列标志:
a)产品名称;
b)生产厂名和地址;
c)分类和规格;
d)生产批号或日期;
e)原料来源;
f)失效日期;
g)贮存条件。
7.3 储运标志应符合GB/T191中的规定。
8 包装
8.1 应采用适宜的包装,确保海藻酸钠产品的安全性和有效性。
8.2 产品的包装、贮存、运输应符合YY/T0313的规定。
附录A
(规范性附录)
海藻酸钠的结构组成和序列结构的1H-核磁测试方法
A.1范围
A.1.1本检测方法用于制备组织工程医疗产品及外科植入物的海藻酸钠。
A.1.2描述海藻酸钠的参数,包括FG(G含量),FM(M含量)M/G、NG>1(连续G单元的平均数量大于1的数值,即不包括-MGM-在内的G单元的平均长度)等。
使用和有效性
采用1H-NMR的方法进行测定时,海藻酸钠溶液的黏性有可能导致NMR谱线加宽,从而影响测定结果。
因此在测定前,需要先通过条件温和的部分水解降低海藻酸钠样品溶液的黏性。
把海藻酸钠溶解于99%D2O中之后冻干,再将其溶解于99.9%D2O再冻干从而制备低1H2O含量的样品。
三乙烯四胺六乙酸(TTHA)被用作螯合剂以防止二价阳离子与海藻酸钠反应,这种反应可以导致谱线加宽以及信号强度的选择性丢失。
A.3材料
A.3.1化学物质
A.3.1.1海藻酸钠样品。
A.3.1.2去离子水。
A.3.1.3HCl(1mol/L,0.1mol/L)。
A.3.1.4NaOH(1mol/L,0.1mol/L)。
A.3.1.5D2O(99%~99.9%,99.9%)。
A.3.1.6三乙烯四胺六乙酸(TTHA,D2O中0.3mol/L,DCl或NaOD调pH值至5~5.5)。
A.3.2仪器
A.3.2.1分析天平(0.1mg)。
A.3.2.2振荡器。
A.3.2.3pH计。
A.3.2.4水浴(100℃)。
A.3.2.5冻干装置。
A.3.2.6NMR仪(推荐300MHz区域强度或更高)。
A.4步骤
A.4.1样品制备
A.4.1.1制备100mL1mg/mL海藻酸钠水溶液。
A.4.1.2HCl(1mol/L,0.1mol/L)调pH值为5.6,将其置于100℃水浴中1h。
A.4.1.3HCl(1mol/L,0.1mol/L)调pH值为3.8,将其置于100℃水浴中30min。
A.4.1.4NaOH(1mol/L,0.1mol/L)调pH值为7~8,冻干样品过夜。
A.4.1.5在99%~99.9%D2O5mL中溶解海藻酸钠样品,再次冻干。
A.4.1.6在99.9%D2O1mL中溶解海藻酸钠样品10mg~12mg。
A.4.1.7在NMR样品管中加入0.7mL海藻酸钠样品,再加入20μL,0.3mol/LTTHA。
A.4.2技术参数
A.4.2.1海藻酸钠1H-NMR参数
1H-NMR应在80℃,20Hz的标准一围脉冲中获得。
原子核1H
质子谱带宽度-0.59.5
扫描次数64
弛豫时间2s
质子脉冲角度90°
扫描时间4.096s
取得样品数据点的数量取决于谱带宽度(Hz)和扫描时间;32768(400Hz时)推荐使用数字式滤器以及适合的数字信号处理器以获得良好的基线。
A.4.2.2参考谱图
见图1。
A.4.3计算
A.4.3.11H-NMR数据由一系列方程式或影响因素进行计算。
这些因素包括(i)数据的最高平均数;(ii)保证黏度(例如,FM=FMM+FMG)。
在图1中显示了信号A,B1,B2,B3,B4和C的积分强度。
1H-NMR中这些信号的意义如下:
red-a:
alphareducing-ends
A:
G
red-b:
betareducing-ends
B1:
GGM
B2:
MGM
B3:
MG
B4:
MM
C:
GG
海藻酸钠的化学成分和序列结构取决于信号的强度,它反映了各个成分的量。
A.4.3.2相关公式如下:
G=0.5[A+C+0.5(B1+B2+B3)]……………………………………(A.1)
M=B4+0.5(B1+B2+B3)…………………………………………(A.2)
GG=0.5[A+C-0.5(B1+B2+B3)]…………………………………(A.3)
MG=GM=0.5(B1+B2+B3)………………………………………(A.4)
MM=B4………………………………………………………(A.5)
GGM=MGG=(B1)0.5(B1+B2+B3)/(B1+B2)……………………………………(A.6)
MGM=(B2)0.5(B1+B2+B3)/(B1+B2)……………………………(A.7)
GGG=GG-GGM……………………………………………………(A.8)
FG=G/(M+G)………………………………………………(A.9)
FM=M/(M+G)………………………………………………(A.10)
FGG=GG/(M+G)………………………………………………(A.11)
FMM=MM/(M+G)………………………………………………(A.12)
FGM=FMG=MG/(M+G)……………………………………………(A.13)
FGGG=GGG/(M+G)……………………………………………(A.14)
FMGM=MGM/(M+G)……………………………………………(A.15)
FGGM=FMGG=GGM/(M+G)…………………………………………(A.16)
NG=FG/FGM………………………………………………(A.17)
NG>1=(FG-FMGM)/FGGM………………………………………(A.18)
NM=FM/FMG………………………………………………(A.19)
如果reducingendsignals也被积分(“red-a”和“red-b”),则平均聚合度的评估公式如下:
DPn=(M+G+red-a+red-b)/(red-a+red-b)………………………(A.20)
式中:
G——α-L-古罗糖醛酸;
M——β-D-甘露糖醛酸;
GG、GGG——α-L-古罗糖醛酸聚合嵌段;
MM、MMM——β-D-甘露糖醛酸聚合嵌段;
MG、GGM、MGM——α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸聚合嵌段;
FG——α-L-古罗糖醛酸含量;
FM——β-D-甘露糖醛酸含量;
FGG、FGGG——α-L-古罗糖醛酸聚合嵌段含量;
FMM——β-D-甘露糖醛酸聚合嵌段含量;
FGM、FMGM、FGGM——α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸含量;
NG——连续的α-L-古罗糖醛酸单体的平均数量;
NG>1——连续的α-L-古罗糖醛酸单体的平均数量大于1的数值,即不包括-MGM-在内的G单元的平均长度;
NM——连续的β-D-甘露糖醛酸单体的平均数量;
DPn——平均聚合度。
A.5标准偏差和结果
A.5.1FG及其标准偏差(SD)应精确到0.01。
A.5.2G含量高的海藻酸钠应给出G含量,例如,FG为0.68(标准偏差=±0.01)。
M含量高的海藻酸钠应给出M含量,例如,FM为0.66(标准偏差=±0.01)。
附录B
(规范性附录)
海藻酸钠平均分子量及其分子量分布的测试方法
B.1 概述
海藻酸钠的分子量决定着它的某些特性,如粘度和/或胶体拉伸率等。
由于上述原因以及这些特性的不同对最终用途的影响,采用直接或间接的方法测定海藻酸钠的分子量是十分必要的。
海藻酸钠是一个确定分子量范围的多分散体系。
分子量可用数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)来表示。
可以通过下述方式来测定:
B.2 依据特性黏数测定海藻酸钠分子量
特性黏数是描述单位质量聚合物在溶液中的流体力学体积,表征聚合物在特定溶剂和温度条件下的一种特性,与浓度无关,与聚合物的平均分子量成比例。
特性黏数的计算公式为:
Mark-Houwink-Sakurada方程[η]=KMα,其中K为常数,M为平均分子量,α为描述聚合物组成的经验常数,通常为0.5~1。
当α=1时,Mη=Mw。
对海藻酸钠而言,在离子强度为0.1时(例如,0.1mol/LNaCl溶液),其指数α接近于1。
通过测定特性黏数,并已知样品的K和α值,则可确定聚合物的粘均分子量。
特性黏数可以通过乌氏黏度计测定。
整个测定过程应确保在温度恒定为20℃,含有0.1mol/LNaCl溶液和足够低的海藻酸钠浓度等条件下进行。
其具体操作方法如下。
精密称取105℃干燥6h的海藻酸钠0.2g,置于约50mL的0.1mol/LNaCl溶液中(内含0.05%乙二胺四乙酸二钠),放置24h后溶解并稀释至100mL,按《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则0633第二法测定特性黏数(η)(温度控制在20℃±0.05℃),其中K=2.0×10-5,α=1,代入Mark-Houwink-Sakurada方程,即可计算得到海藻酸钠的平均分子量。
B.3用凝胶渗透色谱(GPC)与多角度激光散射测定仪(SEC-MALLS)测定海藻酸钠平均分子量及其分子量分布
多角度激光散射测定仪作为测分子量用的附加检测器,不需标准品校准,克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的误差。
由于通常无法获得海藻酸钠的标准品,GPC结合SEC-MALLS方法为测定其平均分子量提供了新的途径。
色谱条件如下:
采用TSKG4000Pwx色谱柱;多角度激光检测器及示差折光检测器;流动相为0.1mol/LNaNO3溶液;流速为0.5mL/min。
采用GPC结合SEC-MALLS,在690.0nm的波长和25℃下测定散射光强。
海藻酸钠溶液的溶剂为超纯水。
将样品按上述色谱条件进样,测定分子量及其分子量分布。
由Zimm图用外推法计算Mn,Mw以及分子量分布指数Mw/Mn。
附录C
(规范性附录)
海藻酸钠蛋白质含量测定
C.1 原理
库马斯亮蓝G-250具有两种色调,在游离状态下呈红色,与蛋白质结合后转为青色,且其色深浅与蛋白质的浓度成正比。
C.2 设备
C.2.1分析天平
C.2.2分光光度计
C.2.1旋涡式混合器
C.3 溶液制备
注:
实验所用试剂均为分析纯。
C.3.1库马斯亮蓝G-250试液:
称取库马斯亮蓝G-250100mg溶解于50ml的95%乙醇中,再加入85%(m/v)的磷酸100mL,并用蒸馏水稀释至1000mL,置于棕色瓶内,室温贮存。
C.3.2 蛋白质标准液:
精确吸取5%牛血清白蛋白标准液0.2mL于1000mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,4℃下贮存。
C.4 样品制备
取海藻酸钠约5mg,精确称重,置于试管中,置于1000mL容量瓶中用蒸馏水稀释定容。
充分振荡混匀,使其完全溶解。
按式(C.1)计算样品管中海藻酸钠含量(μg/mL)。
ρ1=m/1000…………………(C.1)
式中:
m――海藻酸钠质量,μg。
C.5 测定步骤
C.5.1按表C1制备蛋白质标准液系列
表C1蛋白质标准管溶液系列浓度
试管号
0
1
2
3
4
5
蛋白质标准溶液/mL
0
0.1
0.2
0.4
0.8
1.0
蒸馏水/mL
1.0
0.9
0.8
0.6
0.2
0
蛋白质浓度/(μg/mL)
0
1
2
4
8
10
C.5.2在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入5ml的库马斯亮蓝G-250溶液。
用旋涡式混合器使试管中溶液充分混合。
用0号管作对照,用分光光度计测定595nm处各标准管和样品管的吸光度。
C.5.3用标准管绘制吸光度-浓度曲线,根据样品的吸光度值从标准曲线上查得样品管的蛋白质含量。
C.6结果表示
按式(C.2)计算海藻酸钠蛋白质含量ρ3(%):
ρ3(%)=ρ2/ρ1×100…………………(C2)
式中:
ρ1――样品管中海藻酸钠含量,μg/mL;
ρ2――样品管中蛋白质含量,μg/mL。
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- 组织工程医疗器械产品 海藻酸钠 组织 工程 医疗器械 产品 海藻