微生物操作规程Word格式.docx
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4.4平皿培养
4.4.1混合平皿培养
4.4.2平皿涂布培养
4.5.1好氧培养
4.5.2厌氧培养
4.6显微镜检查
4.7细菌革兰氏染色鉴别法
4.8过氧化氢酶试验
第五部分各种菌类的检测方法
5.1一般好氧性微生物的测定
5.1.1细菌总数的测定(培养皿法)
5.1.2细菌总数的测定(膜滤法)
5.1.3酵母中一般好氧性菌的测定
5.2酵母数的测定
5.3厌氧菌总数的测定
5.3.1厌氧菌总数的测定(培养皿法)
5.3.2厌氧菌总数的测定(膜滤法)
5.3.3乳杆菌属、片球菌属、梳状菌属和巨球菌属的检测
5.4大肠菌群的测定
(1)、在化验室操作时,必须穿工作服、帽子,无菌操作要求严格,操作应在无菌室里进行。
(2)、所有的培养物,被污染的玻璃器皿及阳性的检验标本,应放入消毒水中浸泡消毒,再用高压蒸气灭菌或用水煮沸后再清洗。
(3)、工作完毕,双手应用肥皂和水洗净。
(1)、无菌室应分为无菌操作间和缓冲间,缓冲间要比无菌操作间大一些。
(2)、无菌室的高度应在2.2—2.5米为好。
(3)、缓冲间、无菌操作间的门,不能互相对着,应错开,而且是侧拉门。
(4)、缓冲间、无菌间以及操作台内各安装30瓦的紫外灯一支,10—15每平方米安装30瓦的紫外灯管1支为宜。
紫外灯安装在离操作台面1.0—1.5米高度处为宜。
(5)、无菌室的室温应控制在18—25oC,相对湿度为40—60%为宜。
1.1.3操作前的准备工作:
(1)、无菌室应定期用紫外灯进行杀菌,室内每天用紫外灯灭菌20--30分钟,地面应保持清洁,无卫生死角。
(2)、无菌操作必须在超级净化工作台里进行,在使用超级净化工作台前先开紫外灯照射30分钟,然后关掉紫外灯,待30分钟后开照明灯及无菌风。
(3)、经常对无菌室进行无菌程度的检查。
(4)、操作前先将待检样品用75%的酒精消毒后放入无菌操作台。
(5)、进入无菌室前,应先做好个人卫生工作,换上工作鞋,穿工作服,带帽。
工作服、工作鞋、帽、口罩只准在无菌室内专用,不准穿着到其它地方去,并定期进行洗换,每天进行消毒灭菌。
(6)、无菌操作前,双手及在操作台内手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。
1、目的
玻璃器皿初步处理。
2、所用器具及试剂
(1)、毛刷
(2)、餐洗净
(3)、5%碱液
(4)、2%盐酸
(5)、洗液(重铬酸钾—硫酸液)
(6)、自来水
3、操作方法
(1)、一般玻璃器皿:
一般的玻璃器皿(如培养皿、试管、三角瓶等)可用毛刷及洗涤剂去灰尘、油垢,无机盐类等物质,然后用自来水冲洗干净。
以水在内壁均匀分成一薄层而不出现水珠时为油垢除尽的标准,洗刷干净的玻璃器皿晾干后备用。
(2)、污染过的玻璃器皿:
污染过的平皿用水冲洗后放在5%的碱液里煮沸数分钟后,再用自来水冲洗干净,凉干备用。
(3)、不易洗刷干净的玻璃器皿的洗涤先用水初步冲洗后,把水空净,浸泡在洗液里过夜,控净洗液后用自来水冲洗数次,再用蒸馏水涮一下,晾干备用。
(4)、新购的玻璃器皿先用2%盐酸浸泡,再用自来水洗净。
杀菌前的准备工作
2、所用器具
(1)、棉花
(2)、橡胶塞
(3)、牛皮纸或报纸
(4)、棉绳
(1)、试管:
塞上棉塞,然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。
做乳糖胆盐培养基时,将试管头塞上专用塑料塞放入铁丝框。
(2)、吸移液管:
将吸移液管一头塞上棉塞,然后单支或几只用纸包起来,或用盒装。
(3)、三角瓶、抽滤瓶:
将三角瓶(抽滤瓶)口用棉塞塞好,或塞上橡胶塞,然后用牛皮纸把塞头部包起来。
(4)、玻璃洗瓶:
将玻璃洗瓶瓶口用棉塞或橡胶塞塞好,用牛皮纸把塞头部包起来。
(5)、磁性漏斗:
用牛皮纸或报纸将磁性漏斗整个包扎起来。
(6)、平皿:
10个为一组,用牛皮纸包裹或盒装。
概念
灭菌:
指杀灭物体中的所有微生物(包括病原体和非病原体,繁殖体和芽孢)的方法。
消毒:
指杀死物体中的病原微生物的方法。
无菌:
指不含活菌。
防腐:
指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。
1、适用范围此法适用于微生物操作过程中不能用加热、紫外线的地方。
如人手、操作台、取样台等等。
2、所用试剂
(1)、乙醇(酒精)液
(2)、甲醛(福尔马林)液
(3)、硫磺
(4)、漂白粉
(5)、氯水
(1)、用75%的乙醇溶液擦拭或浸泡。
一般取无菌风所用塑料软管及取空瓶所用橡胶塞均用75%的乙醇溶液浸泡。
(2)、一般用1—2%的甲醛液浸泡软管和生产用具。
37—40%的溶液,可用于熏蒸室内空气。
(3)、燃烧硫磺粉时产生SO2,而SO2与水作用则生成亚硫酸,使细菌体细胞脱氧后造成死亡。
(4)、一般成品漂白粉的有效成分是25—32%。
使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内,(对金属有腐蚀作用)放置10—15分钟后冲洗即可。
(
5)、氯灭菌剂的能力以有效氯表示,将氯水配制成50—100PPm的有效氯溶液,可用于浸泡,冲洗和表面杀菌。
但氯对金属有腐蚀作用。
1.4.2物理方法
保持在干燥状态下的玻璃器皿和金属的灭菌。
2、适用范围
本法适用以下的物品:
(1)、干燥的玻璃器皿(吸管、平皿等)
(2)、金属器具(镊子等)
(3)、粉状物品
(4)、瓷器
3、原理
在160oC干热空气中灭菌2小时。
4、仪器和设备
电热干燥箱
5、操作方法
(1)、器具用牛皮纸或灭菌袋包(装)扎,放入金属容器内。
(2)、器具在干燥箱加热前放入,每个器具之间留有足够的空隙,使热空气能畅通。
(3)、关闭箱门接通电源,打开通气孔,使箱内湿空气能逸出,至箱内温度达到100oC时关闭。
(4)、加热至160oC,保持2小时。
(5)、切断电源,冷却至60oC时,打开箱门,取出灭菌器具,并打开箱顶通气口。
6、注意事项
(1)、灭菌时必须注意温度不能超过180oC,以免使棉花、报纸烘焦。
(2)、灭菌时不得打开箱门。
(3)、干燥箱未冷却时,不要取出里面器具,防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸。
1.4.2.2高压蒸汽灭菌
实验室内耐湿热器具的灭菌方法
本法适用以下物品
(1)、易分解的、耐热性的培养基
(2)、膜过滤使用的器具
(3)、橡胶
(4)、耐热性塑料
利用1.5kgf/cm2,121oC的饱和蒸汽,灭菌20分钟。
高压灭菌锅
(1)、包装
a.装入培养基的(箱)瓶用螺旋盖盖上,容器用棉塞塞住,再用牛皮纸包扎。
螺旋盖应微松。
b.在瓶中的培养液不要超过1L,否则灭菌不彻底。
c.容器的上部应留有足够的空间,以便产生气泡。
d.器具用牛皮纸包裹,放入灭菌袋中。
e.器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。
f.各类器具装入釜内时,相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。
(2)、高压杀菌
a.在灭菌器内加入适量的水(不得低于釜底指示横片,露出加热盘管),放入需灭菌物品,盖上内盖,拧紧外盖上的螺栓。
拧紧时要注意对称的进行,否则容易造成漏气。
b.开始加热前,将排气阀打开。
c.待温度上升至100oC时(即当所有的冷空气已排出时),关闭放汽阀门,使压力上升至1.05kgf/cm2(15磅/英吋2),在此压力下维持20分钟。
注意:
加热时间不要过长,但也不要低于指定的20分钟。
(3)、断开电源。
(4)、排气阀关闭的状态下,让釜内压力自然下降。
(5)、打开高压杀菌锅。
注意必须使灭菌釜内无压力为宜。
(6)、灭菌后的物品冷却至室温,取出。
(7)、打开出水阀门,放尽釜内剩水。
高压灭菌器上的安全阀,是保障安全使用的重要机构,不得随意调节。
组成成分在温度在100oC以上会分解的培养基的灭菌。
2、原理
每天在100oC蒸汽灭菌30分钟,连续3天。
第一次加热灭菌是杀灭菌的营养细胞,随后的加热灭菌是将在前一次灭菌后出芽的孢子杀灭。
3、仪器和设备
(1)、蒸汽釜,例如:
排气阀能常开放的高压灭菌锅。
(2)、用电、煤气或蒸汽加热。
4、操作方法
(1)、加热至100oC保持30分钟。
(2)、将培养基冷却,置于25—30oC状况。
(3)、随后两天,重复进行以上的处理。
1.4.2.4过滤灭菌
在实验室条件下对热敏性液体(如糖类、防线菌酮、维生素和血清等)用过滤的方法进行灭菌。
采用孔径比较小的细菌细胞还要小的过滤膜,将微生物过滤除去达到灭菌的目的。
(1)、一般装置
a.能高压杀菌的膜过滤器。
b.耐高压灭菌的加压过滤器架。
c.真空泵d.接收容器。
(2)、在液体中的粒子颗粒大小不等的情况下,用预过滤器除去。
a.处理量在2L以上时,使用直径142mm的过滤膜。
b.处理量在2L以下时,使用直径47mm的过滤膜。
(1)、将过滤器架的排出管与无菌的接收容器连接。
(2)、接受容器的另一端与真空泵连接。
(3)、将镊子灭菌,然后从灭菌包装中取出一次性过滤膜片(0.22微米,带格面朝上),放入过滤筒组件里。
(4)、取下样品容器的塞子,将容器出口用75%酒精灭菌,把样品倒入滤杯中。
(5)、打开真空泵及漏斗支架上的阀门,让样品从过滤器中完全滤出。
(6)、若有必要,先进行预过滤。
1.4.2.5紫外线灭菌
无菌室内的台面和空气的灭菌。
紫外灯发出的紫外线波长为200—300nm之间,具有杀菌能力。
波长为265—266nm时,杀菌力最强。
由于紫外线的作用光谱和核酸的吸收光谱相一致,作为遗传物质的DNA能强烈的吸收紫外线,从而诱导形成胸腺嘧啶二聚体,抑制DNA的复制,达到菌体致死的目的。
(1)、开紫外灯前,可以在室内喷洒酚溶液。
一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落,另一方面可以杀死一部分细菌和芽孢。
(2)、开紫外灯前,室内桌面、椅子等可用消毒液擦洗,以加强紫外灯的灭菌效果。
(3)、开紫外灯照射20—50分钟后,关掉紫外灯。
(4)、30分钟后进无菌室进行操作。
第二部分取样方法
取样方法:
试样主要是从罐或管道中的物料采取。
要注意在取样时避免混入其它的微生物,使样品遭受二次污染。
因为受到二次污染的样品会导入错误的分析结果。
由此可见,取样是分析的重要的第一步。
阀门、水龙头必须是无菌的。
为此要对它们事先进行灭菌。
取样装置要便利操作,易接近罐和管道中的内容物。
取样前,取样装置要灭菌。
通常采用火焰燃烧法,也可采用蒸气法灭菌。
用酒精冲洗和浸泡取样器也能达到同样的灭菌效果。
取样瓶、贮罐、塑料软管、橡胶管等附件在取样前必须灭菌。
样品和已灭菌的装样品的装置,与空气接触的时间尽可能短,但不可与不能灭菌的手指、地面和棚等直接相接触。
为了防止生产现场的卫生状况下降,取样是绝不让样品随意流出,流出的样品应排弃到排水系统,以防止造成污染。
1、密闭容器的取样方法通过取样阀进行
(1)、打开取样阀将管道储存部分放掉。
(2)、用75%的酒精棉球将取样口内外壁消毒。
(3)、火焰灼烧灭菌。
(4)、打开取样口排放样品使取样口冷却。
(5)、将取样瓶的外壁用75%的酒精消毒,然后立即用无菌取样瓶取样品200~300ml、封口。
2、密闭容器的取样方法
3、开放式容器的取样方法
(1)、通过细绳进行
a.把灭菌取样瓶的一头系上细绳,打开瓶盖。
b.取样瓶外壁用75%的酒精消毒。
c.将取样瓶浸入容器水中,取混合均匀的样品200~300ml、封口。
(2)、通过取样勺进行
a.取样勺用水冲洗,后用酒精冲洗。
b.取样勺用火焰灼烧灭菌。
c.将勺子伸入池中冷却。
后将勺子倒转,逆行到液体中部,再将勺子转正,重新取一勺样品。
d.勺子在火焰下离开池子,并将样品快速注入到无菌取样瓶中。
注意事项:
操做过程应迅速,防止污染。
1、直接进行取样。
(1)、用75%的酒精棉球将取样口内外壁消毒。
(2)、火焰灼烧灭菌。
(3)、将待取酵母从取样口放掉大约3桶左右。
(4)、用75%的酒精对无菌广口瓶外壁消毒。
(5)、迅速取样品20~30ml、封口。
2、通过不锈钢勺进行取样
(4)、用酒精冲洗不锈钢勺(每个样品一个)。
(5)、用不锈钢勺采集样品,移入广口瓶内。
(6)、用水清洗小勺,放入杀菌剂里浸泡,以便再次使用。
1、将棉签套入试管中灭菌备用。
2、在表面上用无菌棉签取1—2cm距离来回擦拭数次,插入无菌试管中。
3、将相应培养基倒入无菌试管中培养。
2.5.1空间空气
(1)、取样方法
a.在培养皿中(9cm)倒入琼脂培养基。
b.将培养基放置在待测场所。
打开皿盖,使培养基在大气中曝露10分钟。
c.盖上培养皿盖,带回实验室培养。
结果以(总菌属/9cm2.10分)。
(2)、注意事项
a.使用培养基的种类根据检查目的而有所不同,每一个试剂都有其特定性。
b.培养皿在曝露时,要注意观察培养皿,注意它不能与任何物品接触。
c.一般认为5分钟内100cm2表面上沉落的微生物数,等于10m3空气中的微生物数
(1)、适用范围适用于CO2气体、氮气和空气等压缩气体。
(2)、定性方法:
a.把压缩气体取样口打开大约1分钟,以排出管道内气体。
b.用75%的酒精棉球将取样口内外壁消毒后,用火焰灼烧。
c.慢慢地放出适量的气体冷却取样口。
d.将无菌锥形罩小口连接取样口,调好气体流速使其不能将培养基吹起为佳。
e.打开事先准备好的琼脂培养基培养皿盖使其裹在锥形罩大口内,缓慢地旋转培养皿,曝露1分钟后盖上盖。
f.带回实验室培养。
(3)、定量方法:
d.调好气体流速,使生理盐水不从排气管中溢出为宜。
e.把压缩空气取样阀与洗气瓶(瓶里含有200ml无菌生理盐水)的进气导管连接。
f.打开取样阀,放出3分钟的气体通过液体,将气体中含有的微生物阻留在无菌液体里。
g.将洗气瓶带回实验室,用无菌膜过滤内容液。
1、适用范围:
瓶盖、麦芽、大麦、酒花等固体物质
2、方法:
(1)、在无菌条件下,将固体物质置于无菌广口瓶中。
(2)、倒入生理盐水,洗涤。
(3)、将洗涤液进行膜过滤。
适用范围:
硅藻土、稳定剂之类的粉状物质。
方法:
(1)、在无菌条件下,将粉状物质用小勺置于无菌试管中。
(2)、在试管中倒入NBB-B培养基进行培养。
1、适用范围本法适用于灌装时经巴氏杀菌的任何类型的啤酒瓶、听(罐)。
2、操作方法:
(1)、在洗瓶机和灌酒机间的传送带取一定数量的样品。
取瓶样点确定在洗瓶机出口处的中央位置及两端位置。
灌装机入口之前的位置,不必取瓶样。
(2)、瓶口用橡胶塞或牛皮纸包裹,带回实验室。
(3)、各瓶内加入灭菌的生理盐水50ml,小心振荡瓶。
用膜滤器抽滤,进行微生物培养。
(4)、听(罐)内加入灭菌生理盐水10ml,小心振荡听(罐)。
吸取1ml放入培养基中,进行微生物培养。
培养基是人工配置的微生物营养料,即用人工方法将多种物质按照各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种混合营养料。
其主要用途为:
繁殖及分离纯种微生物,鉴别微生物,研究微生物的生理及生化特征,制造菌种,传代保存微生物等。
按其用途可分为基础培养基、增菌培养基、选择性培养基、鉴别培养基、厌氧培养基。
增菌培养基是根据待检菌的特征与营养要求,使其迅速生长繁殖。
选择培养基与鉴别培养基是根据各种微生物的生化反应不同,进一步鉴别它是属于哪一类的微生物。
1、营养琼脂培养基
精确称取按标准配方合成的营养琼脂培养基4.5克,加入100ml蒸馏水中,加热搅拌至完全溶解,分装至三角瓶,并注明培养基名称、配制日期,在121℃下高压灭菌20分钟。
待压力复零后,打开排气阀取出。
2、乳糖胆盐培养基(单料)
精确称取按标准配方合成的乳糖胆盐培养基3.5克,加入100ml蒸馏水中,加热溶解,并分装试管,每支管10ml并放入一个小倒管(产气管),在116℃下高压灭菌20分钟,压力复零后取出备用。
3、麦汁固体培养基
精确称取按标准配方合成的培养基50克,倒入1000ml蒸馏水中,加热搅拌至完全溶解,分装至三角瓶,在121℃下高压灭菌10分钟,待压力复零后,取出备用。
4、合成UBA培养基
按培养基配方说明,称取62gUBA培养基粉末加入750ml水中,加热至沸搅拌至完全溶解,趁热加入250ml未脱气的啤酒,轻轻搅拌混合、分装至三角瓶,并注明培养基名称、配制日期,在121℃下高压灭菌15分钟,待压力复零后,取出备用。
5、UBAA培养基
(UBA+10ppm防线菌酮)在100mL46℃的UBA培养基中加入1mL防线菌酮原液,混匀即可。
6、1000ppm防线菌酮原液:
将100mg防线菌酮溶于100ml去离子水中,用孔径为0.2um滤膜过滤,滤液收集于无菌容器中,此步骤必须进行无菌操作,2~50C储存。
将灭菌后的培养基置于37℃恒温培养箱中,24hr无菌培养,若无菌生长,则可保存备用。
如有污染则弃之不用。
保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定,已制备好的培养基要保存于冰箱中。
在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30分钟,使其与室温一致再使用,因为气体的溶解度可因温度上升而降低,特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡,这一点必须注意。
NBB培养基是Prof.Back专门为检查啤酒有害菌而开发的。
它的全称为NachweismediumfuerBierschaedlicheBaklerien,即啤酒有害细菌培养基。
1、分类常见的NBB产品有
(1)、NBB-A(固体培养基)
(2)、NBB-B(液体培养基)
(3)、NBB-C(浓缩型液体培养基)
(4)、盒装NBB-P(粉末)和NBB-AGAR(用于培养空气细菌的条块)。
在NBB中加入了放线菌酮,能抑制酵母菌的生长。
NBB-A和NBB-B在中加入了酸碱指示剂氯酚红,来指示酸碱的变化,遇酸变黄,遇碱变红。
2、NBB-A培养基
(1)、适用范围酵母样品;
啤酒、水等澄清透明的样品;
需划线的样品。
(2)、结果鉴定伴生细菌在NBB-A上的生长是微弱缓慢的,并且通常NBB-A都不会变黄。
而在NBB-A上判断有啤酒有害菌生长的安全依据是形成菌落并伴随NBB-A的颜色改变。
3、NBB-B培养基
(1)、适用范围
酵母样品、前酵样品、后酵样品、二氧化碳气体样、麦汁样、成品啤酒样及啤酒厂二次污染的检测。
(2)、结果鉴定
在达到一定污染程度或有典型啤酒有害菌存在时,NBB-B中的酸碱指示剂会由红变黄。
在几种特殊情况下NBB-B不变黄。
a.在极轻微的污染时,不会导致NBB-B变色。
b.巨球菌、潜在的啤酒有害菌多变黄杆菌及发酵单胞菌不会使PH值降到5.0以下,因而不会导致NBB-B变色。
c.酵母自溶产碱使PH值上升妨碍了指示剂的变色也导致NBB-B不变黄。
(3)、二次污染的检测
a.无菌棉签擦拭样品,需要在25—28oC恒温培养3天。
做不做厌氧处理均可(深层培养原理)。
b.NBB-B变黄:
1天—重度污染;
2天—中度污染;
3天—轻度污染。
4、NBB-C培养基
(1)、适用范围未过滤浑酒(含有酵母的样品)、成品酒、清酒、麦汁及水等
a.对于未过滤的浑酒样,可通过镜检混浊和沉淀来鉴定。
b.对于清亮样品,可通过浑浊、沉淀来判断。
当样品内有污染存在时,能观察到严重的浑浊或沉淀。
无浑浊或沉淀的样品可直接记录结果“无污染”。
1、使用
(1)、使用前应提前20分钟开机。
(2)、按动照明开关即可打开日光灯。
如需消毒,则应提前20分钟打开紫外线灯,进行杀菌消毒。
(3)、利用风机调整键可进行风速调整,通过∧键及∨键向上或向下调整风机转速,并可断开风机。
2、注意事项
(1)、工作台面上,禁止存放不必要的物品,以保证工作区域内的洁净气流不受干扰。
(2)、禁止在工作台面上记录,工作时应尽量避免作明显扰乱气流的动作。
(3)、根据环境洁净度,每3~6个月将中效过滤器中的滤料拆下清洗。
一般情况下,当无纺布滤料容纳尘埃较多、表面发黑时即可拆下进行清洗,或者予以更换。
(4)、风机转速调至最大时,仍不能达到所需要的风速时(即风速≤0.2m/s),则必须更换高效空气过滤器。
1、目的为了进行直接平皿培养,对含菌量在1000个/毫升以上的试样进行稀释。
2、器具和装置
放入9ml灭菌稀释液。
稀释液可以是与试样组成相同的灭过菌的液体,或是0.9%NaCl水溶液。
(2)、已灭菌吸管:
1ml。
(1)、为得到50—500个/毫升的菌浓度,按10倍稀释度计算次数。
这个次数假定为n。
(2)、在(n+1)各试管中放入灭菌的稀释水,并排为1列。
(3)、用吸管吸取1ml试样原液,放入No.1试管中,混匀。
再用一只新的吸管,从No.1试管中吸取稀释液1ml放入No.2试管中,混匀。
此操作持续到No.n+1试管。
(4)、从连续编号的最终三个试管中,吸取0.1ml试样,移入平皿培养。
4、菌浓度的计算根据平皿培养的结果,计算出原液的菌
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