鉴定菌株的标准操作规程Word文档下载推荐.docx
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357F
3对引物正反向测通后,拼接成1500bp左右的16SrDNA序列。
4.设备和材料
1.1
器材
移液器(1000μL、200μL、100μL、10μL);
涡旋振荡器;
EppendorfMixMate;
离心机;
水浴锅;
电泳仪;
制冰机;
低温冰箱;
PCR仪:
Veriti96WellThermalCycler;
凝胶成像仪:
VersaDocMP4000;
基因分析仪:
AB3500、AB3130
1.2试剂
DNA快速提取试剂:
PrepManUltra;
琼脂糖;
PCR试剂:
Taq酶,10×
TaqBuffer(Mg2+),dNTPs,ddH2O等;
ExoSAP-IT;
测序试剂:
BigDyeTerminator,5×
SequencingBuffer;
BigDyeXTerminatorPurificationKit;
1.3耗材
移液器吸头:
1000μL、200μL、10μL;
离心管:
1.5mL、200μL;
MicroAmpTMOptical96-WellReactionPlate;
MicroAmpTMOpticalAdhesiveFilm;
1.4引物
16SrDNA
名称
序列
扩增长度
第1部分
正向引物27F
5'
-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
500bp左右
反向引物519R
-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'
第2部分
正向引物357F
-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
750bp左右
反向引物1115R
-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3'
第3部分
正向引物926F
-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3'
560bp左右
反向引物1492R
-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'
其中M=C:
A,Y=C:
T.K=G:
T,R=A:
G,S=G:
C.W=A:
T;
all1:
1
5.
操作流程
6.实验方法
1.5核酸提取:
挑取单菌落,然后置于装有100μLPrepManUltra的离心管中,涡旋震荡混匀30s左右,然后100℃水浴10min后,以离心机最大转速离心3min,取10μL上清液与490μLddH2O(即稀释50倍),混匀作为下步PCR的模板DNA。
提取的DNA于-20℃保存。
1.6基因扩增
1.6.1PCR反应体系
试剂
使用量(25μL体系)
模板DNA
2μL(10ng~100ng)
Taq酶(5U/μL)
0.2μL
10×
TaqBuffer(Mg2+)
2.5μL
dNTPs(各2.5mM)
2μL
引物F(1μM)
5μL
引物R(1μM)
ddH2O
8.3μL
备注:
DNA模板量通常在100ng以下,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板使用量。
PCR反应体系应在冰中配置,然后置于冰箱中冷却3~5min,最后放于PCR仪上进行反应,这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
1.6.2PCR反应条件
94℃:
10min
30s
58℃:
72℃:
45s
5min
4℃:
∞
1.6.3电泳
称取1g琼脂糖置于100mLTAE电泳缓冲液中,加热融化,待温度降至60℃左右时,均匀铺板,制成1%的琼脂糖凝胶。
PCR反应结束后,加样,以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳结束后,染色,用凝胶成像仪观察,拍照,记录实验结果。
1.7产物纯化
1.7.1每5μLPCR产物加入2μLExoSAP-IT试剂,混匀。
1.7.2放入PCR仪中,37℃温育15min,80℃温育15min。
1.7.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。
1.8测序反应
1.8.1测序反应体系
使用量(10μL体系)
1μL
引物(1μM)
1.6μL
BigDyeTerminator
5×
SequencingBuffer
5.4μL
1.8.2测序反应条件
96℃:
2min
55℃:
15s
60℃:
4min
1.8.3测序反应纯化(BigDyeXTerminatorPurificationKit)
5.4.3.1每管加入27μLSAMSolution和6μLBigDyeXTerminatorSolution。
5.4.3.2放在EppendorfMixMate上2000rpm震荡30min。
5.4.3.3在离心机上以1000×
g离心2min。
5.4.3.4每管吸取10μL上清液于96孔板中,放入测序仪中测序。
1.9序列比对
基因测序仪得到的测序结果,在MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对,得到菌种的种属信息。
7.关键说明
1.1提取细菌基因组DNA时,对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌,可挑取一菌环菌株,置于100μLddH2O中,混匀,沸水热变性10min后,离心3min分离,稀释50倍后做为PCR模板。
必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。
1.2PCR及测序反应时,为了保证酶的活性,整个体系应在冰中配置;
然后置于低温冰箱中冷却3~5min,最后放于PCR仪上进行反应,这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。
1.316SrDNA序列的前500bp序列变化较大,包含有丰富的细菌种属的特异性信息,所以对于绝大多数菌株来说,只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
具体参照附录。
PCR出现非特异性条带的原因:
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:
必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
减少酶量,或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量,减少循环次数。
用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
模板浓度过高
10ul体系100ngDNA
附录
(资料性附录)
1.细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图
M:
DL2000;
1:
引物27F和519R的PCR产物(第1部分500bp)
2:
引物357F和1115R的PCR产物(第2部分750bp)
3:
引物926F和1492R的PCR产物(第3部分560bp)
2.细菌16SrDNA鉴定结果
1.116SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息:
菌株TL140924的鉴定结果
1.216SrDNA前500bp不足以反映细菌的种属信息:
菌株70528的鉴定结果
1.316SrDNA的全序列信息:
如附录2.2、2.3所示,当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时,则需要测其16SrDNA全长序列以将其区分。
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- 关 键 词:
- 鉴定 菌株 标准 操作规程