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陶兴无
化学工业出版社,2005
《现代生物工程导论》
贺小贤
科学出版社,2005
《生物工程导论》
岑沛霖
化学工业出版社,2004
第1讲
第1次课,2课时
章、节名称
第一章绪论
教学目的
与教学要求
本章从生物技术的定义、发展历史、现代生物工程的基本内容、当代生物技术的应用概况等方面,深入浅出地介绍了生物工程的基础知识,使学生对近代及当代的生物技术发展有所了解,提高他们刻苦学习专业知识,完善自己的知识结构,为建设祖国而奋斗的自觉性和积极性。
教学重、难点
【教学重点】生物技术和生物工程;
生物工程和其他学科的关系;
生物工程的基本内容;
生物工程在各行各业的应用
【教学难点】现代生物技术带来的问题
教学方法
讲授加板书、多媒体教学
教学内容
一生物技术的概述
二生物工程的内容
三现代生物技术的应用和研究热点
四现代生物技术带来的问题
同学们大家好。
大家都知道每次社会经济的飞跃都伴随着某种革命,第一次工业革命发明了什么?
(蒸汽机和纺纱机)解放了人的双手;
第二次技术革命是什么?
(信息技术)扩展了人的大脑;
那么我们现在的社会正在发生新的变革。
随着人类对自身和生物的了解日益加深,改造自身和获得新生物的愿望也越来越迫切。
也就有了第三次技术革命(生物技术) 生物技术将是未来经济发展的新动力。
为什么这么说?
当今人类社会面临最重大的问题和挑战∶人口膨胀;
粮食短缺;
疾病危害;
环境污染;
能源危机;
资源匮乏;
生态平衡破坏;
生物物种大量消亡。
解决人类生存与发展所面临的一系列重大问题,在很大程度上将依赖于生命科学的发展。
生命科学对人类经济、科技、政治和社会发展的作用是全方位的。
一什么是生物技术
1982年,国际合作与发展组织(ICDO)对生物技术进行了定义:
即应用自然科学及工程学原理,依靠微生物、动物体、植物体作为生物发应器,将原料加工以提供产品来为社会服务的技术。
美国政府技术顾问委员会(OAT)的定义:
应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术,其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。
1定义:
是以现代生命科学理论为基础,利用生物体及其细胞的、亚细胞的和分子的组成部分,结合工程学、信息学等手段开展研究及制造产品,或改造动物、植物、微生物等,并使其具有所期望的品质、特性,从而为社会提供商品和服务的综合性技术体系。
生物工程定义:
以现代生命科学为基础,把生物体系与工程学技术有机结合在一起,按照预先的设计,定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料,产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
特征:
21世纪最具潜力的高新技术
多学科、交叉、综合的技术
影响最为深远最广泛的技术
2分类:
(1)传统生物技术
传统生物技术主要是指通过微生物的初级发酵来生产产品的技术。
如酱油、酒、面包、酸奶及其它发酵食品的传统工艺.
它包括三个重要的步骤:
第一步:
上游处理过程。
所谓上游过程,是指对于粗材料进行加工,作为微生物的营养和能量来源;
第二步:
发酵和转化。
发酵指的是目的微生物的大量生长发酵过程必须在一个大的生物反应器内进行,反应器容积通常大于lOOL,可以连续生产某一个目的产品;
第三步:
下游处理过程。
主要是指所需目的产物的纯化过程,人们既可以从细胞的培养液中纯化,也可以直接从细胞中纯化。
纯化方法包括蒸馏、萃取、结晶、干燥、过滤等。
(2)现代生物技术:
现代生物技术是在20世纪70年代于细胞遗传学和分子生物学基础上发展起来的以基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等为主要研究内容的技术体系。
在现代高新技术领域中,它与信息技术、新材料科学并列为当今三大前沿科学,并且占据着更重要的地位。
3生物技术与生物工程的关系
1基因工程:
基因工程是指在微观领域(分子水平)中,根据分子生物学和遗传学原理,设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中,使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物,最终实现该技术的商业价值。
2蛋白质工程
“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”,即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究,包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。
蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上,对蛋白质人工改造与合成,最终获得商业化的产品。
3酶工程
是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象,改造并应用酶的特异催化功能。
目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术。
传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用。
随着科学的发展,尤其是基因工程技术的日趋完善,为酶工程赋予了新的内容,特别是利用DNA操作技术,修饰改造酶分子的结构或活性位点、酶与底物作用位点,重组酶的生产,模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容。
4细胞工程
利用工程学原理进行细胞生物学的基础研究和制造使用活细胞的产品,如组织工程和生物加工工程。
前者是利用移植的细胞、骨架、DNA、蛋白质或蛋白质片段替代或修复已受伤或损坏的组织和器官;
后者是利用活细胞生产生物医药产品。
5发酵工程
现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。
现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。
基因工程是核心,带动其他四大工程的发展,四大工程的发展又促使基因工程发展更迅猛。
基因工程和细胞工程看作生物工程的上游处理技术,将发酵工程和酶工程看作生物工程的下游处理技术。
基因工程、细胞工程和发酵工程中所需的酶往往是通过酶工程来获得的。
1医药:
生物制药;
基因治疗;
人工器官
2农业和畜牧业
转基因植物:
抗病虫害新品种、抗逆新品种、高品质新品种
转基因动物:
生产有用蛋白质和高品质的畜产品
生物反应器:
利用动植物细胞或组织作为生物反应器,直接生产有用蛋白质
3轻工与食品
新型食品;
营养食品;
保健食品;
轻工用酶
4环境
污染治理;
废物利用;
污染物生物降解
5特点:
(八高一低)
四现代生物技术带来的问题
1经过基因改造的生物或生物产品是否会对其他生物体和环境造成危害?
2开发和使用基因工程药物是否会降低自然界的生物多样性?
3人是否也可以成为基因工程操作的对象?
4基因诊断的程序是否会侵犯个人隐私权?
5用现代生物技术生产的药物进行治疗是否会压抑同样有效的传统治疗方式
6农业生物技术是否会彻底改变传统的耕作方式?
7现代生物技术专利的申请是否会阻止科学家之间自由的学术思想交流,影响宗教和文化
8现代生物技术能否有效对付严重危害和威胁人类健康与生命安全的传染性疾病?
作业、讨论题、思考题:
什么叫做生物工程?
按照研究对象,生物工程包括哪些方面?
第2讲
第2次课,2课时
第二章基因工程
熟悉基因的基本概念、性质,掌握基因的功能,了解基因工程的诞生背景
【教学重点】基因的结构、功能,DNA双链的性质,遗传信息的传递法则
【教学难点】导致基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大突破
第一节基因的基本概念
一什么是基因
二基因的结构
三基因的功能
第二节基因工程的概述
一基因工程的诞生
上节课过渡到本次课的内容
基因(Gene,Mendelianfactor)是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列,也称为遗传因子,是控制性状的基本遗传单位。
基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。
孟德尔发现了遗传因子:
(1)生物性状的遗传由遗传因子决定(遗传因子后来被称为基因)。
(2)遗传因子在体细胞内成对存在,其中一个成员来自父本,另一个成员来自母本
(3)遗传因子符合自由组合规律
二基因的结构(复习)
1核酸的化学组成(包括DNA的化学组成、脱氧核苷酸的分类)
2DNA的分子结构
3基因的结构
(1)基因的三个特性
基因可以自我复制
基因决定性状
基因可以突变
(2)分类:
结构基因:
一条基因决定一条多肽链
调控基因:
调节控制结构基因表达
1携带遗传信息:
从遗传学上来说,基因代表一个遗传单位,一个功能单位,一个突变单位。
2基因的复制
3基因的表达
由DNA控制的蛋白质合成涉及两个基本过程:
第一步,DNA的遗传信息转录到mRNA中,发生在细胞核中;
第二步,将mRNA的信息翻译成蛋白质的氨基酸序列,在细胞质中进行。
原核生物中遗传信息的转录和翻译则简单一些
简单回顾下原核和真核生物基因转录翻译的不同
导致基因工程诞生的是分子生物学领域的理论上的三大发现和技术上的三大发明
理论上的三大发现:
基因的物质基础是DNA、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码子的破译
技术上的三大发明:
工具酶的发明、载体、逆转录酶
有了这些理论核技术的武装,基因工程的临盆降生指日可待,Berg和Cohen两位科学的“助产士”,把基因工程接到了人间。
我们应该记住他们——
1.第一个实现DNA重组的人-Berg
1972年,Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA,经过连接组成重组的DNA分子。
Berg是第一个实现DNA重组的人。
2.第一个取得基因工程成功的人-Cohen
1973年,CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割,连接成一个新的质粒,转化E.coli,在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。
这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子,这一年被定为基因工程诞生的元年。
基因工程诞生时理论上的三大发现和技术上的三大突破是什么?
第3讲
第3次课,2课时
了解基因工程的概念、特点和意义,熟悉基因工程的步骤,掌握PCR法和限制性内切酶的特点
【教学重点】基因工程的本质、特点,基因工程的步骤,目的基因的获取方法,基因工程中主要的工具酶
【教学难点】基因工程的操作步骤,目的基因的合成,如PCR法,工具酶的功能和应用
讲授加板书、多媒体教学、放视频
哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术?
1)DNA序列自动测序仪
2)PCR技术
思考:
基因工程培育抗虫棉的简要过程:
上述培育抗虫棉的关键步骤是什么?
二基因工程的概念
三基因工程的特点和意义
第三节基因工程的操作
一基因工程的步骤
二目的基因的分离和合成
三基因工程工具酶
二基因工程的概念
基因工程:
在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”,对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞进行无性繁殖,使重组基因在受体细胞内表达,产生出所需要的基因产物。
基因工程的别名
基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
基本过程
剪切→拼接→导入→表达
结果
人类需要的基因产物
实质
基因重组
三基因工程的特点和意义
1特点:
跨物种性-外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。
如人的胰岛素基因可以转移到大肠杆菌上表达。
无性扩增-外源DNA在寄主细胞内可大量扩增,和高水平表达。
2意义:
基因工程是按照人的意志定向培育生物新品种、新类型乃至创造自然界从未有过的新生物的最佳途径。
基因工程是现代新技术革命的标志
第三节基因工程的操作
一、基因工程的步骤
在体外通过人工剪、接,将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体),然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。
因为通过人工设计,得到一定的设计方案,故称为基因工程。
由于整个操作在分子水平上进行,所以也称分子克隆。
基因工程的基本特点是,分子水平操作,细胞水平表达。
四个基本条件:
目的基因、工具酶、载体、受体细胞
二目的基因的分离与合成
1提取目的基因的方法
(一):
直接分离基因——鸟枪法
将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段,再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。
只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达,基因工程就算成功了。
该法最大的缺点是带有很大的盲目性,工作量大,成功率低。
且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去
2提取目的基因的方法
(二):
反转录法
以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需的基因。
3提取目的基因的方法(三)
根据已知蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因。
优点
缺点
鸟枪法
操作简便广泛使用
工作量大,盲目,分离出来的有时并非一个基因
专一性强
操作过程麻烦,mRNA很不稳定,要求的技术条件较高
根据已知氨基酸合成DNA法
专一性最强
仅限于合成核苷酸对较少的简单基因
4人工合成-PCR技术原理及反应过程
原理:
DNA双链复制
反应过程:
①加热至90~95℃,目的基因DNA解链
②冷却至55~60℃,引物结合到互补DNA链
③加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
1基因的剪刀——限制性内切酶(简称限制酶)
限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶,能将外来的DNA切断,由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶。
特点:
特异性。
即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割DNA分子。
限制酶的识别位点
一般特征(4点):
(1)Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点(或切割位点)。
(2)它能识别dsDNA的4-6bp(碱基对)的回文序列并水解该部分的核苷键。
一般来说是4-6bp,有6个以上的,但没有4个以下的。
(3)识别顺序呈二重对称(回文结构),即180度旋转对称。
如:
GCCGGTNACGAATTC
HhaCGGCMaeⅢCANTGEcoRⅠCTTAAG
(4)特异性
限制酶的切割位点:
限制性对dsDNA2条链同时切割(其具体切割点,即磷酸二酯键断开的位点,相对二重对称轴的位置而异)产生3种不同切口:
1.
形成平头末端(flush或bluntend)如
-TC↓GA-smaⅠbsuRⅠor–TC3ˊ+5ˊGA-
-AG↓CT-AluⅠ-AG5ˊ+3ˊCT-
2.形成5′-粘性末端(5′-cohesiveend即3′延伸末端)
5′-GAATTC3′EcoRⅠ5′-GAATTC-3′
+
3′-CTTAAG5′3′-CTTAAG-5′
3.形成3′-粘性末端(3′-cohesiveend)
5′CTGCAG3′pstⅠG-3′5′-CTGCA
+
3′GACGTC5′ACGTC-5′3′-G
粘性末端(stickyend)—被限制酶切开的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,他们之间正好互补配对,这样的切口叫黏性末端
2基因的针线——DNA连接酶
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来,即把梯子两边扶手的断口连接起来,这样一个重组的DNA分子就形成了。
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的,最初是在大肠杆菌细胞中发现的。
它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'
-PO4与另一DNA链的3'
-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
3其他工具酶
TaqDNA聚合酶:
75-80℃,主要用于PCR扩增及DNA序列测定。
逆转录酶:
mRNAcDNA主要用于组建DNA文库。
T4多核苷酸酶主要用于制备杂交探针及测序引物的5’磷酸标记
1简述限制性内切酶和DNA连接酶的作用机制
2如何采用PCR技术从生物材料中分离出目的基因?
第4讲
第4次课,2课时
掌握基因工程的载体的类型、功用和构建,熟悉基因导入受体细胞的方法,了解基因工程的应用和发展
【教学重点】载体应具备的条件,质粒载体和噬菌体载体的特点,目的基因导入细胞的方法
【教学难点】结合理论了解基因工程的应用
四基因工程载体
五目的基因导入受体细胞
第四节基因工程的应用和发展
四基因工程载体
1定义:
将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。
简言之,就是基因的运载工具。
功能:
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件:
1).在宿主细胞内必须能够自主复制(具备复制原点)
2).具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,供外源DNA片断插入,同时不影响复制
3).有一定的选择标记,用于筛选
4).具有较高的拷贝数,便于载体的制备
目前常用的载体有质粒载体(plasmid)噬菌体载体和病毒载体
2质粒:
是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。
质粒是基因工程最常用的运载体。
绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。
有的一个细菌中有一个,有的一个细菌中有多个。
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒,其中常含有抗药基因,如四环素的标记基因。
质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用,但复制只能在宿主细胞内成。
通过重组克隆的“插入失活”来进行筛选
pBR322—→插入在Tetr中,基因型为Tets、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长,在含有四环素培养基上不生长;
pBR322—→插入在Ampr中,基因型为Tetr、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长,在含有四环素培养基可生长;
而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段,从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。
3λ噬菌体载体
(1)线状双链DNA分子,全长48.502kb。
(2).两端的5’末端具有12碱基的突出互补的粘性末端(cohensiveend,cos),该末端称为cos位点。
可被λ编码的A蛋白所识别
(3).当λ侵入宿主细胞后,线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子
λ噬菌体的改造
⑴切去非必须区段,在切去的同时,加载目的基因(2.5kb或更大);
⑵去掉太多的酶位点,每种酶只留1-2个切口;
⑶
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