散发性结直肠癌hMLH1蛋白表达的研究Word格式文档下载.docx
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错配修复基因;
hMLH1基因;
免疫组织化学
ResearchonExpressionofhMLH1InSporadicColorectalCarcinoma
Abstract:
ObjectiveToanalysetheroleofhMLH1inthecarcinogenesisofsporadiccolorectalcarcinomaandtoevaluateitspossibleclinicalsignificance,WedeterminedtheexpressionofmismatchrepairgenehMLH1insporadiccolorectalcarcinoma.MethodsTheexpressionofmismatchrepairgenehMLH1in60casesofsporadiccolorectalcarcinomawereanalyzedusingPV6000immunohistochemicalmethod.ResultsLossofhMLH1expressionwerefoundin11cases(11/60,%)sporadiccolorectalcarcinoma.LossofhMLH1expressiondidnotcorrelatewithpatient‘sgender,tumorgrosstype,tumorsize,invasivedepth,lymphnodemetastasis,distantmetastasisandDukesstage(P>),butwascloselyrelatedtopatient‘sage,tumorlocation,histologicaltypeandhistologicalgrade(P<orP<).ConclusionTherewasasubsetofsporadiccolorectalcarcinomadisplayingMMRdefective,withspeciallyclinicalandpathologicalfeatures.
KeyWords:
Colorectalcarcinoma;
Mismatchrepairgene;
hMLH1gene;
Immunohistochemistry
结直肠癌(colorectalcarcinoma,CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一,随着医学生物技术以及分子生物学的飞速发展,人们已认识到CRC的发生发展并不遵循单一的途径[1]。
本研究旨在用免疫组化方法检测错配修复基因hMLH1在散发性CRC组织的蛋白表达状况,分析其与临床病理学参数之间的关系,探讨hMLH1基因在散发性CRC发病机制中所起的作用,为指导临床实践提供可靠的理论依据。
1材料和方法
1病例选择与临床资料收集青岛大学医学院附属医院2004年1月至2006年5月临床资料完整的散发性CRC常规石蜡包埋组织标本60例,其中男性38例,女性22例。
年龄30岁~88岁,平均年龄(±
)岁。
所有标本切片均经两位资深病理医师确诊,不包括遗传性非息肉病性大肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer,HNPCC)患者,所有病例手术前均无系统的放疗和化疗病史。
2免疫组织化学检测方法
主要试剂和工作浓度兔抗人hMLH1多克隆抗体购自美国SantaCruz公司,工作浓度分别为1∶50。
PV6000二步法免疫组化检测试剂购自美国Zymed公司。
实验方法取存档蜡块厚3μm连续切片,二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后置于新鲜配制的3%H2O2去离子水室温孵育10min,然后蒸馏水冲洗。
将切片放入盛有1mM EDTA(pH,1∶50)抗原修复液的容器中,置微波炉内进行微波修复,室温下冷却,PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤。
滴加一抗,室温下孵育3h。
PBS洗涤,滴加PV6000二抗,置于37℃电热恒温水箱孵育20min,PBS洗涤,切片在%DAB(二氨基联苯胺盐酸盐)+1%H2O2中显色,见棕黄色颗粒后终止反应。
苏木精复染,盐酸酒精分化,氨水反兰。
常规脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。
用PBS取代一抗作阴性对照。
3结果判断标准所有切片均由两位病理科资深专家阅片。
每张切片选择有代表性区域,并避开切片的周边区域,光镜下随机观察10个高倍镜视野,记录10×
100个阳性细胞的百分比。
阳性结果参照Friedrichs等[2]的免疫组化评判标准,分别观察染色强度和阳性细胞所占的百分数,先按染色强度计分(染色深浅需与背景着色相对比),0分为无着色,1分为浅黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。
再按阳性细胞所占百分比计分,0分为阴性,1分为阳性细胞≤10%,2分为阳性细胞占11%~50%,3分为阳性细胞占51%~80%,4分为阳性细胞>80%。
将染色强度与阳性细胞百分比计分的积分相乘,乘积≥2分为hMLH1蛋白表达正常,乘积0分~1分为hMLH1蛋白表达缺失。
hMLH1蛋白阳性染色定位在黏膜上皮细胞胞浆或核染色,癌旁正常肠黏膜和淋巴细胞为内对照阳性。
4统计学方法应用SPSS统计软件,行χ2或Fisher,s精确概率法检验。
P<为差异有显着性。
2结果
60例散发性CRC中hMLH1缺失表达11例(占%)见图1~图2。
图1-图2略
hMLH1缺失表达与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型和分化程度密切相关(P<或P<),而与患者性别、肿瘤大体类型、肿块大小、浸润深度、淋巴结及远处转移与否和患者的Dukes分期均无显着相关性(P>)。
见表1。
表1散发性结直肠癌hMLH1与临床病理特征之间的相关性 略
3讨论
CRC是我国一种常见的恶性肿瘤,占胃肠道肿瘤的第二位,近年发病率有逐年上升的趋势[3]。
1993年Ionow和Aaltonen等发现,在几乎所有的HNPCC肿瘤和约12%~15%的散发性CRC中存在着微卫星上的突变,称作微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI),由此提出了另一条崭新的途径——错配修复途径[4]。
它的基本原理是MMR基因保证了DNA复制的高度保真,一旦MMR基因发生突变或启动子甲基化引起错配修复基因失活,导致机体错配修复功能的降低,进而导致整个基因组的不稳定,MMR功能缺陷的表现型是高度的微卫星不稳定(MSIH),又称之为复制错误(repliationerror,RER)阳性,从而使某些癌基因和抑癌基因的突变在体内得到快速聚集,肿瘤由此发生[5],表现为肿瘤细胞的DNA多为二倍体或近二倍体的含量,在此途径中,hMLH1和hMSH2这两个MMR基因起主要作用[6~9]。
RER阳性的散发性CRC与RER阴性者相比,具有不同的临床病理、分子生物学特征,表现为:
发病年龄较轻;
多位于近端结肠,且易伴发肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤;
对某些化疗药物(如5FU、顺铂等)有原发性耐药;
肿瘤细胞DNA多为二倍体或近二倍体;
低分化腺癌、黏液腺癌及印戒细胞癌多见,但较少发生淋巴结转移,生物学行为较好[10]。
近年研究发现,hMLH1蛋白的表达变化结果可以很好地预示MMR功能缺陷的存在[11]。
本研究结果显示,在60例散发性CRC病例中,有11例hMLH1缺失表达,占%(11/60),表明一定比例的散发性CRC中存在着MMR基因功能缺陷,此结果与Chiaraualli等[12]的研究结果基本一致。
结果还显示hMLH1缺失表达与患者的年龄(≤40岁)、肿瘤的部位(近端结肠)、组织学类型(黏液腺癌)和分化程度(低分化)关系密切(P<或P<),与以上所述的RER阳性的散发性CRC的临床病理、分子生物学特征相符合。
目前认为RER阳性散发性CRC主要是由于hMLH1基因启动子甲基化导致hMLH1基因的转录和翻译的静默而出现蛋白的表达缺失与MSI引起[13,14]。
运用免疫组化技术检测hMLH1基因的蛋白表达,方法简便、快速有效,随着研究的深入,对治疗方案的制定和
患者的远期预后情况的预测可能有重要的临床应用价值。
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