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多花黄精其根部中富含的黄酮类化合物即是主要的营养因子,又是药理因子,对人体具有重要的生理保健功效[2]。
研究表明,黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血压、镇痛、提高雌性激素等生物的生物活性[3~5];
有些黄酮类化合物具有利尿和调节血管渗透压的作用,有的具有抑制肿瘤细胞的作用。
有关研究表明,黄酮类化合物是一类具有广泛开发前景的天然抗氧剂[6],黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基,故显酸性。
酸性强弱因酚羟基数目、位置而异[7]。
鉴于黄精的种种药用价值和研究价值,因而本文研究讨论黄酮的最佳提取工艺。
目前,我国报道的黄酮有效成分提取方法有有机溶剂提取法、水提取法、超临界萃取法、超声波提取法、酶法等[8~13]。
为了获得黄精叶中总黄酮提取的最佳工艺,本试验以乙醇提取法对黄精主根中的总黄酮进行提取,以提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度为考察因素,用分光光度法测定总黄酮含量为指标,利用单因素的方法分析对多花黄精主根总黄酮提取率的影响,以选择出最优的提取条件[14~16]。
2材料仪器和试验过程
2.1.1材料的准备和处理
多花黄精根采摘于5月下旬,采摘后清水洗净,剔除泥沙,放入烘箱60℃烘干2h后温度调至105℃放置12h至恒重,用粉碎机碾碎,过孔径2mm筛,保存备用。
2.1.2试验试剂
芦丁为生化试剂,西安惠丰生化厂生产;
95%乙醇,武汉市雪环医用消毒品有限公司生产;
氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯,湖北大学化工厂生产;
亚硝酸钠为分析纯,武汉江北化学试剂厂生产。
2.1.3试验器材
HH-4恒温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司产品),RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣有限公司产品),粉碎机(上海康仪仪器有限公司产品),UV784型紫外可见分光光度计(上海天普分析仪器有限公司产品),BS-110S型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司产品),DHG29146A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司产品)。
2.2试验过程
2.2.1标准曲线的绘制
取干燥至恒重的芦丁50mg,置于25ml容量瓶中,加75%乙醇使之溶解并定容至刻度。
取上述溶液10ml,置于100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀即的芦丁标准液。
分别准确吸取芦丁标准液0ml,1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,6ml置于25ml容量瓶中,各加水至6ml,再加5%亚硝酸钠1ml,摇匀放置6min;
然后加10%硝酸铝1ml,摇匀放置6min;
然后加4%氢氧化钠10ml,用蒸馏水定容止刻度,放置15min。
最后(以蒸馏水作空白)在紫外分光光度计波长510nm处分别测定吸光度记录在表(表2-1),再以芦丁浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制表格如表2-1所示,由表2-1绘制标准曲线如图2-1所示。
表2-1标准曲线表
编号
1
2
3
4
5
6
芦丁溶液浓度(mg/ml)
0.008
0.016
0.024
0.032
0.040
0.048
吸光度(OD)
0.110
0.285
0.376
0.495
0.591
0.680
图2-1芦丁标准曲线
图2-1所示标准曲线方程:
y=14.268X+0.026,R²
=0.9910,R≈0.995(R²
为绝对系数,R为相关系数)其吸光度A与芦丁浓度C呈现良好的线性关系,该数学模型能反映实际试验结果。
2.2.2单因子试验
每次试验均取5g黄精根粉末于五支试管中,即每支试管1g。
以乙醇浓度、水浴温度、水浴时间、料液比四个因子按照单一变量法则得出变量因子最适范围。
按下图表2-2,表2-3,表2-4和表2-5中依次编号。
表2-2乙醇浓度的选择试验
实验条件
试管编号
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
乙醇浓度
75%
80%
85%
90%
95%
水浴温度
70℃
水浴时间
2h
料液比
1:
20
表2-3水浴温度选择的试验
40℃
50℃
60℃
80℃
表2-4水浴时间选择的试验
实验条件
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
1h
1.5h
2.5h
3h
表2-5料液比的选择试验
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
10
15
25
加热过程中充分摇匀,使总黄酮充分的溶于乙醇溶液中。
到时间后,取出试管,过滤后得到滤液,将滤液置于旋转蒸发仪上进行蒸干处理,烘干后溶于乙醇溶液中倒入50mL的容量瓶中,滴定至刻度,混合均匀后用移液枪移取0.1mL的溶液,置于25mL容量瓶中,加水至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,混匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%氢氧化钠试液10mL,再加水至刻度,摇匀,放置15min,待测。
采用分光光度发在510nm处测定其吸光度。
2.2.5正交试验
在单因素的基础之上选择不同的乙醇浓度,水浴时间,水浴温度和料液比时间四个因素作为条件进行正交实验,试验情况见表2-6。
表2-6正交试验各因素的条件
试验号
因素
A乙醇浓度
B料液比
C提取时间
D提取温度
65℃
2.0h
75℃
7
8
9
3试验结果与分析
3.1单因素试验
3.1.1乙醇体积分数对多花黄精黄酮提取效果的影响
在提取温度70℃,提取时间2h,液料比1:
20的条件下,分别选取乙醇浓度为75%,80%,85%,90%,95%对材料进行提取。
过滤后将滤液定容至25ml,取0.1ml测定其黄酮含量,结果如图3-1所示。
图3-1乙醇浓度对多花黄精总黄酮提取效果的影响
由图3-1可知乙醇浓度在75%到90%时吸光度呈现上升趋势,但当乙醇浓度超过90%,吸光度便开始下降,可见在乙醇浓度到达90%的时候对于总黄酮的提取达到一个峰值。
故在实际操作过程中应以乙醇浓度90%为宜。
3.1.2提取温度对多花黄精总黄酮提取效果的影响
在提取时间2h,乙醇浓度75%,液料比1:
20的条件下选取温度为40℃,50℃,60℃,70℃,80℃进行提取。
过滤后将滤液定容至25ml,取0.1ml测定其黄酮含量,结果如图3-2所示。
图3-2提取温度对多花黄精黄酮提取效果的影响
由图3-2可知,在提取温度在40℃到70℃时,随着温度的增加,吸光度不断增大。
但当温度超出70℃后,随着温度的变化,吸光度变化不大趋于稳定。
可见在提取温度为70℃对总黄酮的提取最好。
3.1.3水浴时间对多花黄精总黄酮提取效果的影响
在提取温度70℃,液料比1:
20,乙醇浓度75%,分别水浴提取1h,1.5h,2h,2.5h,3h。
过滤后将滤液定容至25ml,取0.1ml测定其黄酮含量,结果如图3-4所示。
图3-3提取时间对多花黄精总黄酮提取效果的影响
由图3-3可知,在提取时间为1h到2h时随着提取时间的增加,吸光度不断增大。
但当提取时间超过2h,随着时间的增加,吸光度逐渐趋于稳定,可见当提取时间为2h时黄酮提取速度就达到最大。
故实际操作中以提取时间2h为宜。
3.1.4液料比对多花黄精总黄酮提取效果的影响
在提取温度70℃,提取时间2h,乙醇浓度75%的条件下,分别用1:
5,1:
10,1:
15,1:
20,1:
25的液料比进行提取。
过滤后将滤液定容至25ml,取0.1ml测定其黄酮含量,结果如图3-5所示。
图3-4液料比对多花黄精总黄酮提取效果的影响
由图3-4可知,在液料比1:
10到1:
20中,吸光度随着液料比的增加不断增加。
但在液料比超过1:
20后,吸光度便随液料比的增加下降。
可见在液料比1:
20时达到峰值。
故以液料比1:
20为最佳。
3.2正交试验
表3-1正交试验结果
序号
黄酮提取量/(mg/g)
0.301
0.403
0.382
0.454
0.462
0.434
0.364
0.401
0.311
K1
0.373
0.378
0.358
K2
0.450
0.422
0.389
K3
0.359
0.412
R
0.091
0.049
0.025
0.054
从表3-1黄精的主根总黄酮提取正交试验可以看出,主根总黄酮的提取工艺中影响因素A的极差为R为0.091,B为0.049,C为0.025,D为0.054,即乙醇浓度的对,黄精主根总黄酮的提取影响最大,其次是B、D、C。
由此可见,各因素对多花黄精主根总黄酮提取的影响顺序为A>
B>
D>
C。
影响因素A各水平之和分别为K1为0.382,K2为0.450,K3为0.359,由此可知影响提取因素优势为A2>
A1>
A3,表示当乙醇浓度为90%,同理可知B2>
B1>
B3,C2>
C1>
C3,D2>
D1>
D3最佳组合为A2B2C2D2,即在乙醇浓度90%,提取时间2h,液料比1:
20,提取温度70℃时,在此条件下提取效果最好。
4讨论
本次试验通过单因子实验,正交试验对影响多花黄精根中黄酮的提取率的四个影响因子进行比较分析,选择出组合搭配最佳的一组,从整个实验过程来看,影响实验准确性的因素有很多,比如根研磨成粉末是否彻底,水浴时间是否严格控制等。
在实验过程中许多细小的因素就单一而言对实验的结果影响不大,但在多个细小因素共同作用下对实验的结果产生重要的影响,加大了实验误差从而导致所得数据不准确。
本研究结果表明,不同的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度等对多花黄精根中黄酮提取效果均产生不同程度的影响。
其中乙醇浓度对于根中总黄酮提取影响达极显著水平,当乙醇浓度在90%左右时,提取效果最好,当不再这个浓度范围内时,不管浓度降低还是上升提取率都降低。
料液比对根中总黄酮提取影响达重要因素,随着料液比的增大提取率也显著增大,但当料液比达到1:
20后提取效果变化不明显。
因此,为节约能源,减少投入,在提取多花黄精根中总黄酮时以不低于1:
20的料液比比较合适。
提取温度对多花黄精根中总黄酮提取影响达为次重要因素,当温度达到70℃时提取效果最好。
提取时间对多花黄精根中总黄酮提取影响较小,提取时间增加时候提取率的增加并不明显,当提取时间到2h后提取率基本保持不变。
因此可见乙醇溶液提取多花黄精根中总黄酮的最佳工艺条件为:
料液比为1:
20的90%乙醇溶液于70℃条件下提取2h。
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