呼吸道九联检操作规程SOP文档格式.docx

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免疫室和检验科有关工作人员必须认真学习，严格遵照执行。

（NO.2版依据检验技术和我科工作发展及管理工作的需求进行的补充完善和改进另行通知）。

任何个人不得更改，实际工作中如发现不妥之处，请按程序以文字形式向审核人汇报；

在未经批准人同意/批准新文件之前，仍执行此文。

编写人

修改内容及修改人

批准人

生效日期

HDHY-MYJY-P003-2011

第1页共2页

呼吸道九联检操作规程

1.项目中英文名称：

九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒（间接免疫荧光法）

2.实验原理与方法：

2.1原理：

间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。

样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。

在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。

用免疫荧光显微镜观察结果。

2.2方法：

间接免疫荧光法

3.标本的要求：

需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。

使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。

血清样本采集后如不在8小时内检测应2~8º

C冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20º

C）保存。

不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。

不要使用高血脂或污染的血清。

若样本中含有微粒要离心使之澄清。

4.仪器：

荧光显微镜

5.试剂厂家及名称：

郑州安图绿科生物工程有限公司

6.操作步骤：

1.使用前，将所有试剂平衡至室温。

载玻片平衡至室温后再打开。

2.样本的稀释：

按1:

1比例稀释血清样本，即25µ

L血清加入25µ

LPBS2中。

阴阳性对照34不需要稀释。

3.用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：

将30µ

L稀释后的血清加入150µ

L吸附剂中，彻底混匀。

阴阳性对照3和4不需吸附剂处理。

处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。

4.在载玻片1的每孔中加15µ

L吸附剂处理过的血清（一份样本对应一个载玻片）。

在一个载玻片的每孔中加入15µ

L不稀释的阳性对照3，在另一个载玻片的每孔中加入15µ

L不稀释的阴性对照4。

5.将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。

6.用PBS2的缓慢水流冲洗载玻片1（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。

再用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。

7.载玻片1自然晾干。

8.每孔加入15µ

L抗人IgMFITC结合物溶液5M（不需稀释）。

9.将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。

10.重复6和7的洗涤步骤。

11.加几小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。

12.尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。

如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8º

C不超过24小时。

HDHY-MYJY-P004-2011

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*简明操作程序（将风干改成晾干）

广州市胸科医院

检验科操作标准程序文件

HDHY-MYJY-P007-2011

*有效性判断

每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。

观察到的荧光模式应为：

阳性对照：

腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核、胞浆或胞膜荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；

军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光；

支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。

阴性对照：

军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。

*样本结果判断

阳性结果：

可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；

军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；

支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。

阴性结果：

可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。

【检验结果的解释】

1.每一批产品在放行前都要经过更加严格的内部质量控制（Q.C.）的检验。

质控品可溯源到经过内部确认的参考血清盘。

2.如果所有细胞或第10孔出现荧光表明存在抗核或抗细胞抗体，不能判为阳性，应用其他方法进行检测。

当质控孔中无荧光时一定要查明病因。

3.由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体，军团菌阳性结果需结合临床症状综合评价。

建议做较高稀释度的检测来提高阳性预测值。

4.与说明书中所列结果不同不能判为阳性。

5.在初次感染和再次感染的过程中，IgG和IgM抗体有不同的表现方式：

初次感染时，几乎在所有的情况下IgM和IgG均出现（IgM早于IgG出现）；

而再次感染时可能不出现IgM，因此IgG的检测是唯一有用的诊断方法。

在许多疾病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM一般情况下仅在感染后2—3个月存在于血清中，因此是近期感染的一个有效标志物。

6.九种病原体IgM抗体阴性及阳性结果的荧光染色图谱：

阳性结果图谱：

HDHY-MYJY-P008-2011

阴性结果图谱：

【检验方法的局限性】

1.本试剂盒用于检测人血清。

2.建议用户仔细阅读和理解说明书，严格按照程序进行操作才能获得可靠的检测结果。

特别是样本和试剂的正确吸取以及仔细的洗板、温育的时间控制对获得准确结果都很重要。

3.样本的检测结果应与临床评价以及其他诊断方法结合使用。

4.本检测不能指出感染部位，不能单独使用。

5.抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性。

6.在感染早期采集的样本可能检测不到IgG，在这种情况下建议采用IgM检测，或者在14-21天后采集第二个血清样本，并与原标本同时检测来确定是否发生血清转换。

7.婴儿的IgG检测结果要作谨慎解释，因为出生前母体的IgG被动的传递给了胎儿。

对6个月以下的婴儿IgM检测是更为有用感染标志物。

8.单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。

应采集双份样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的明显升高。

9.对患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用本方法评价。

质控孔用于检测这种现象。

在嗜肺军团菌和Q热立克次体中，有时血清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。

当出现这种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了。

10.未对本检测在疗效随访方面的性能做过评估。

11.除了肺炎外，未对本技术在肺炎衣原体引起的其他疾病方面的性能作过评估。

广州市医院

HDHY-MYJY-P009-2011

【产品性能指标】

1.灵敏度和特异性

嗜肺军团菌血清1型：

与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测82份血清样本，结果如下：

样本数

灵敏度

特异性

IgM

82

94.4%

98.4%

有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。

肺炎支原体：

与一种ELISA试剂盒对照检测62份血清样本，结果如下：

62

96.8%

100.0%

Q热立克次体：

与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测74份血清样本，结果如下：

74

97.6%

肺炎衣原体：

与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测61份血清样本，结果如下：

61

98．0%

HDHY-MYJY-P010-2011

腺病毒：

与一种ELISA试剂盒对照检测74份血清样本，结果如下：

85.7%

97.0%

呼吸道合胞病毒：

与一种ELISA试剂盒对照检测97份血清样本，结果如下：

97

93.8%

甲型流感病毒：

与一种ELISA试剂盒对照检测46份血清样本，结果如下：

46

94.1%

96.4%

乙型流感病毒：

与一种ELISA试剂盒对照检测40份血清样本，结果如下：

40

副流感病毒1、2和3型：

与一种ELISA试剂盒对照检测36份血清样本。

结果如下：

36

96.3%

HDHY-MYJY-P011-2011

2.精密度

分析内精密度：

在相同实验条件下由同一个操作人员在同一次试验中对3份血清（2份阳性和1份阴性）分别进行5组加样检测。

结果：

滴度变化不超过一个稀释度。

分析间精密度：

在5种不同条件下（不同操作人员或不同试验日期）对3份血清（2份阳性和1份阴性）进行检测。

3.交叉反应和干扰

检测20份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和Q热立克次体）、革兰氏阴性细菌（布鲁氏菌，沙门氏菌）和抗核抗体阳性血清样本。

检测12份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、肺炎衣原体和Q热立克次体）阳性血清样本。

检测20份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌）、同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。

检测20份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、Q热立克次体和肺炎支原体），同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。

检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）阳性血清样本。

HDHY-MYJY-P012-2011

检测10份病毒综合病症组（腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）或根据病毒分类（麻疹）阳性血清样本。

检测8份病毒综合病症组（RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性的血清样本。

检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性血清样本。

副流感病毒血清1、2和3型：

检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型和乙型流感病毒和腺病毒）阳性血清样本。

结论：

检测结果表明本试剂盒与上述参考品无交叉反应或干扰，从而证实了该试剂盒的特异性反应。

其它干扰研究

对25份类风湿因子阳性血清进行了2种病毒和2种细菌抗原IgG和IgM抗体的检测。

对另外两份血清进行了每种抗原IgG和IgM抗体的检测。

在IgM检测中，用抗IgG抗体对血清进行了吸附处理。

结果显示，吸附剂可以有效避免类风湿因子的干扰。

经验证，吸附剂也可以有效地避免IgG抗体过量造成的假阴性。

HDHY-MYJY-P013-2011

【注意事项】

1.本产品用于体外诊断，仅限专业人员使用。

2.仅使用试剂盒内的组分，不要混用不同试剂盒或不同厂家的试剂组分。

3.每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。

4.包装如有损坏请勿使用。

5.切勿用嘴吸移液管加样。

6.本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人源性物质。

尽管本试剂盒中的人血清质控品已经测试为HBsAg、HCV抗体和HIV抗体阴性，质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。

孔内包被的经灭活的嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型，也仍应视为具有潜在感染性并小心处置。

目前没有方法可以确保这些或其他感染性物质不存在，因此所有的材料应视为具有潜在感染性进行处置，应遵守当地关于临床废弃物处理的法规。

7.结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度＜0.1%），避免接触酸和重金属。

8.封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在高温下。

9.伊文斯蓝（浓度＜0.1%）是一种致癌物。

请勿接触皮肤和眼睛。

万一接触到该溶液，用水彻底冲洗并到医院检查。

10.仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。

11.载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。

12.显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。

13.不要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。

14.每个载玻片只能使用一次。

不要分割，也不要再使用没有用过的孔。

15.试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。

16.吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。

HDHY-MYJY-P015-2011

17.标签符号：

体外诊断用医疗器械

使用有效期

8º

C

2º

C

储存条件2-8º

可用于检测的次数（规格）

批号

目录号

使用说明书

每个载玻片上反应孔的数量