邬氏黄丝曲霉产生的四个新组织蛋白酶抑制剂Wortamannilactones EGWord文件下载.docx
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WortamannilactonesE对人正常细胞L-20细胞系在150mol/l浓度下未显示毒性,其小鼠的急性毒性LD50为500mg/kg。
结论首次从土壤微生物代谢产物中分离得到了含有氧杂二环-[2.2.1]-庚烷和二氢吡喃环子结构的化合物;
首次报道该类化合物具有组织蛋白酶B的抑制活性和较低的体内外毒性。
关键词:
组织蛋白酶B;
抑制剂;
邬氏黄丝曲霉;
WortamannilactonesE-G,fournovelcathepsinBinhibitorfrommetabolitesoftheFungusTalaromyceswortmannii
DONGYue-sheng1,LinJie2,LuXin-hua2,ZHENGZhi-hui2,LIUMei2,RENXiao2,BAIYu2,ZHANGhua2,YANGJun-shan3(1.DepartmentofBioscienceandBiotechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian,116024;
2.NationalMicrobialMedicineEngineering&
ResearchCenter,NewDrugR&
DCo.LtdofNorthChinaPharmaceuticalGroupCo.Ltd,Shijiazhuang050015;
3.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChinaAcademyofMedicalSciences&
PekingUnionMedicalCollege,Beijing100094)
Abstract:
OBJCTIVETostudythechemicalconstituentsfromTalaromyceswortmanniiandbiologicalactivity.METHODSTheconstituentswereisolatedandpurifiedfromthecultureofTalaromyceswortmannii,theirstructureweredeterminedbythespectroscopicanalysis.Thecompound’scathepsinBinhibitoryactivities,invivoinvitrotoxicitieswerealsostudied.RESULTFournovelcompoundsWortamannilactonesE-GwereobtainedandtheirIC50valuesagainstcathepsinBwere4.3,6.5,13.0,and6.0mol/l,respectively.WortamannilactonesEshowednotoxicitytohumannormalcelllineL-20at150uM,anditsLD50againstmousewas500mg/kg.COUCLUSIONCompoundswithoxabicyclo-[2.2.1]heptaneanddihydropyranringsubstructureswereobtainedfromsoilmicroorganismandreportedwithcathepsinBinhibitoryactivities,invivoinvitrolowtoxicityatthefirsttime.
Keywords:
CathepsinB;
Inhibitor;
Talaromyceswortmannii;
组织蛋白酶(cathepsin)是一大类裂解肽键的蛋白水解酶,其中组织蛋白酶B属于半胱氨酸蛋白酶。
近年来发现,组织蛋白酶B(CB)在结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌等多种恶性肿瘤中均呈现高表达,与恶性肿瘤的演进关系密切,而且其对细胞外基质的降解被认为是侵袭与转移的关键步骤之一。
此外,研究也表明CB与呼吸道、关节等慢性炎症的发生相关[1]。
一些CB抑制剂被发现,但以蛋白和化学合成抑制剂为主,目前天然产物中发现的CB的抑制剂的报道比较少[2]。
Musil和Jia等分别对CB及CB与多肽抑制剂的复合物进行了晶体结构测定,这些研究对组织蛋白酶抑制剂的作用机理具有十分重要的意义[3,4]。
本实验室发现一株邬氏黄丝曲霉F01Z0195具有CB的抑制活性。
本文报道其发酵、分离、结构鉴定和生物学活性、毒性的研究以及活性化合物和组织蛋白酶B相互作用方式的初步研究。
1.材料和方法:
1.1试剂和仪器:
F01Z0195分离自我国云南省土壤,经鉴定为邬氏黄丝曲霉[5],现保藏于中国典型微生物保藏中心,编号为CGMCCNo.1224。
CathepsinB(Sigma),Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin(Sigma)。
其他药品均为国产分析纯试剂。
Wallac1420Victor2(PerkinElme);
WatersLC-MSZQ2000(ESI模式),BrukerDaltonicsApexIImassspectrometer(FAB模式);
VarianInova-500NMR光谱仪;
美国Waters公司(515泵和PDA检测器).
1.2CB活性测定方法:
CB活性测定方法参照Halangk等的方法[6],并进行适当改进
1.3WortamannilactonesE对人正常细胞L-20细胞的毒性测定。
准确称取待测WortamannilactonesE,配制成为不同浓度的溶液(DMSO),加入到人正常细胞L-20中,计算其IC50值。
1.4WortamannilactonesE的小鼠急性毒性实验:
将WortamannilactonesE溶于少量DMSO中,加入0.5%CMC-Na配置为不同浓度的悬浊液各3ml。
分别对5只小鼠进行腹腔注射,小鼠平均体重为20g。
1.5邬氏黄丝曲霉F01Z0195的培养和分离纯化方法:
培养方法同前期发表的文献[7]。
F01Z0195的固体培养物4kg,用4000ml乙酸乙酯萃取,减压蒸去溶剂。
将粗提物经硅胶柱色谱,氯仿-甲醇梯度洗脱,减压蒸干。
活性物质部分用制备型HPLC进行单组分的制备(流动相为CH3CN-H2O(85/15,V/V),流速6ml/min,检测波长312nm),得到WortamannilactonesE(12.8mg),F(8.2mg),G(5.4mg)和H(4.8mg)。
1.6WortamannilactonesE和组织蛋白酶B相互作用的初步研究:
组织蛋白酶B的X射线晶体衍射结构从ProteinDataBank数据库(http:
//www.rcsb.org/)中下载(登陆号:
1THE)。
WortamannilactonesE的三维结构由Chem3D生成,并使用其半经验量子化学模块MOPAC中的AM1算法对其进行结构优化。
使用VMD和PyMOL软件进行对接研究。
2.结果
2.1
WortamannilactonesE-H的化学结构:
WortmannilactoneE为微黄色粉末UV(MeOH)297,312,326nm显示该化合物中存在着四烯结构,IR(KBr)νmax:
1800,1754cm-1;
显示有羰基的存在,WortmannilactoneE的平面结构是通过分析其1H,13CNMR,COSY,HMQC和HMBC相关确定的(Table1).1H,13CNMR谱显示该化合物含有氧杂二环-[2.2.1]-庚烷子结构[8]。
NMR数据显示该化合物含有一个共轭四烯结构。
HMBC谱中H-C(16)/C(18),C(20),H-C(18)/C(16),C(20)以及H-C(20)/C(16)的相关表明和该化合物存在着prugosenesA1中二氢吡喃环子结构相同的结构片段[8]。
这三个子结构通过HMBC谱的相关连接为一个完整的结构。
图1.WortmannilactoneE和G主要的NOE相关
Fig1.KeyNOEcorrelationsofWortmannilactoneEandG
HRFAB-MS结果显示WortmannilactoneF和WortmannilactoneE有相同的分子式。
HMBC分析显示WortmannilactoneE和F具有相同的平面结构,WortmannilactoneE和F为立体异构。
WortmannilactoneE和F的相对立体构型主要是通过NOESY相关确定,在两个化合物中,均存在H-C(5)/H-(7-CH3),H-C(8)/H-(3CH3),H-C(5)/H-C(6)的NOESY相关,表明氧杂二环-[2.2.1]-庚烷子结构的相对构型为3S*,5R*,6S*,7R*,其7位构型和prugoseneA(1-3)不相同。
1HNMR中四烯中氢的耦合常数(J=15.0Hz)表明四烯部分均为E式。
NOESY谱中,H-C(16)和H-C(14)、H-(20-CH3)相关,而在其H-C(14)反位的H-(15-CH3)和H-C(20)相关,表明H-C(16)和20-CH3为反式构象(Figure1)。
WortmannilactoneE的H-C(20)和H-(19-CH3)在NOESY中相关,而WortmannilactoneF的H-C(20)和H-(19-OH)在NOESY中相关(inDMSO-d6),表明在19-CH3和20-CH3在WortmannilactoneE中为反式,在WortmannilactoneF中为顺式。
所以WortmannilactoneE和F的相对构型分别为16S*,19S*,20S*和16S*,19R*,20S*。
HRFAB-MS显示wortmannilactoneG的分子式为C27H38O6。
UV和NMR显示该化合物也存在着以E式存在的四烯结构,其1DNMR数据,以及存在着H-C(3)toC
(2),C(8),H-(4-CH3),H-C(5)toC(8),H-C(16)toC(18),C(20),C(15-CH3)以及C(17-CH3),H-(17-CH3)toC(16),C(18)的HMBC相关显示该化合物存在着2,3-二甲基-γ-内酯结构(Table2)。
在NOESY谱中,H-(4-CH3)和H-C(6)、H-C(9),H-C(8)H-C(3)、H-C(5)的相关,以及H-C(5)和H-C(6)的较大的耦合常数(J=11Hz)表明H-C(3)/4-CH3,4-CH3/H-C(5),H-C(5)/H-C(6)均是反式。
另外在NOESY谱中H-C(16)和H-C(14),H-(20-CH3),以及H-(15-H3C)和H-(17-CH3)的相关表明H-C(16)/17-CH3,H-C(16)/H-C(20)均为反式。
根据以上结果确定了WortmannilactoneG的结构,其相对立体构想为3R*,4R*,5S*,6S*,16S*,17R*,20S*。
HRFAB-MS表明WortmannilactoneH的分子式为C26H34O5,其IR,1Hand13CNMR数据显示该化合物的氧杂二环-[2.2.1]-庚烷子结构和WortmannilactoneE相同,而二氢吡喃环部分和WortmannilactoneG相同,其四烯子结构和WortmannilactoneE,F,G相同。
可以确定该化合物的化学结构。
2.2WortamannilactonesE-H的NMR数据
WortmannilactoneE
(1):
Amorphouspowder;
[]25D-38.0(c=0.12,MeOH);
UV(MeOH)max(log):
297(4.12),312(4.35),326(4.08)nm;
IR(KBr)νmax:
3300,1800,1754,1390,970cm-1;
1HNMR(500MHz,CD3OD)δ6.50(1H,dd,J=15,11Hz,H-13),6.38(1H,dd,J=15,11Hz,H-9),6.36(1H,dd,J=15,11Hz,H-11),6.23(2H,dd,J=15,11Hz,H-10,12),5.84(1H,d,J=11Hz,H-14),5.71(1H,d,J=15Hz,H-8),5.53(1H,d,J=1.5Hz,H-18),4.95(1H,d,J=2.5Hz,H-6),4.26(1H,s,H-16),3.47(1H,q,J=6.5,H-20),2.81(1H,qd,J=7,2Hz,H-5),1.80(3H,br,s,15-CH3),1.55(3H,br,s,17-CH3),1.12(3H,d,J=7Hz,5-CH3),1.09(3H,s,7-CH3),1.09(3H,d,J=5.5Hz,20-CH3),1.07(3H,s,19-CH3),1.01(3H,s,3-CH3);
13CNMR(125MHz,CD3OD)δ209.5(C,C-4),173.4(C,C-2),136.0(C,C-15),135.6(C,C-17),135.5(CH,C-9),134.9(CH,C-11),134.8(CH,C-12),133.5(CH,C-10),131.3(CH,C-8),130.9(CH,C-18),130.4(CH,C-13,14),86.3(CH,C-6),81.5(CH,C-16),73.1(CH,C-20),70.8(C,C-3),68.1(C,C-19),59.5(C,C-7),44.4(CH,C-5),25.6(CH3,19-CH3),20.1(CH3,17-CH3),16.9(CH3,7-CH3),15.7(CH3,15-CH3),14.4(CH3,20-CH3),11.7(CH3,5-CH3),5.0(CH3,3-CH3);
ESI-MS(+),m/z449[M+Na]+;
ESI-MS(-),m/z425[M-H]-;
HRFAB-MS(+),m/z449.2298[M+Na]+(calcd449.2304forC26H34O5Na).
WortmannilactoneF
(2):
[]25D-65.0(c=0.17,MeOH);
297(4.12),312(4.36),326(4.08)nm;
3300,1800,1755,1390,970cm-1;
1HNMR(500MHz,CD3OD)δ6.52(1H,dd,J=15,11Hz,H-13),6.40(1H,dd,J=15,11Hz,H-9),6.38(1H,dd,J=15,11Hz,H-11),6.26(1H,dd,J=15,11Hz,H-10),6.23(1H,dd,J=15,11Hz,H-12),5.97(1H,d,J=11Hz,H-14),5.71(1H,d,J=15Hz,H-8),5.52(1H,d,J=1.5Hz,H-18),4.97(1H,d,J=2.5Hz,H-6),4.22(1H,s,H-16),3.58(1H,q,J=6.5,H-20),3.16(1H,s,19-OH,inDMSO),2.82(1H,qd,J=7,2Hz,H-5),1.82(3H,br,s,15-CH3),1.52(3H,br,s,17-CH3),1.13(3H,d,J=7Hz,5-CH3),1.10(3H,s,7-CH3),1.05(3H,s,19-CH3),1.03(3H,d,J=6Hz,20-CH3),1.01(3H,s,3-CH3);
13CNMR(125MHz,CD3OD)δ209.5(C,C-4),173.4(C,C-2),136.4(C,C-15),135.6(CH,C-9),134.9(CH,C-11),134.8(CH,C-12),134.3(C,C-17),133.4(CH,C-10),132.4(CH,C-18),131.2(CH,C-8),130.7(CH,C-13),130.5(CH,C-14),86.3(CH,C-6),81.8(CH,C-16),72.5(CH,C-20),70.8(C,C-3),69.8(C,C-19),59.5(C,C-7),44.4(CH,C-5),22.0(CH3,19-CH3),19.8(CH3,17-CH3),16.9(CH3,7-CH3),15.8(CH3,15-CH3),14.7(CH3,20-CH3),11.7(CH3,5-CH3),5.0(CH3,3-CH3);
HRFAB-MS(+),m/z449.2292[M+Na]+(calcd449.2304forC26H34O5Na).
WortmannilactoneG(3):
[]25D-26.0(c=0.15,MeOH);
UV(MeOH)max(log)297(4.08),312(4.32),326(4.18)nm;
IR(KBr)νmax3300,2920,1680,1390,970cm-1;
1HNMR(500MHz,CD3OD)δ6.53(1H,dd,J=15,11Hz,H-13),6.33(1H,dd,J=15,11Hz,H-10),6.22(1H,m,H-11,12),6.19(1H,dd,J=15,11Hz,H-9),6.12(1H,d,J=11Hz,H-14),5.72(1H,d,J=15Hz,H-8),5.29(1H,d,J=2Hz,H-18),4.36(1H,d,J=11Hz,H-5),4.12(1H,q,J=7Hz,H-20),3.98(1H,s,H-16),3.64(3H,s,7-CH3),2.75(1H,q,J=7Hz,H-3),2.71(1H,dd,J=11,7Hz,H-6),1.83(3H,br,s,15-CH3),1.58(3H,br,s,19-CH3),1.24(3H,d,J=6.5Hz,20-CH3),1.02(3H,J=7Hz,6-CH3),0.98(3H,s,4-CH3),0.96(3H,s,17-CH3),0.90(3H,d,J=7Hz,3-CH3);
13CNMR(125MHz,CD3OD)δ179.1(C,C-2),175.9(C,C-7),137.8(C,C-15),137.3(C,C-19),136.7(CH,C-8),135.1(CH,C-10),133.3(CH,C-12),132.6(CH,C-9,11),130.8(CH,C-18),130.7(CH,C-13),128.0(CH,C-14),87.2(CH,C-5),78.8(CH,C-16),74.0(CH,C-20),71.2(C,C-17),52.5(CH3,7-CH3),49.5(C,C-4),47.9(CH,C-3),42.4(CH,C-6),22.8(CH3,17-CH3),19.3(CH3,19-CH3),17.5(CH3,20-CH3),16.1(CH3,15-CH3),14.3(CH3,6-CH3),11.9(CH3,4-CH3),7.6(CH3,3-CH3);
ESI-MS(+)m/z459[M+H]+;
ESI-MS(-),m/z457[M-H]-;
HRFAB-MS(+),m/z459.2758[M+H]+(calcd459.2747forC27H39O6).
WortmannilactoneH(4):
[]25D-46.0(c=0.19,MeOH);
UV(MeOH)max(log)297(4.11
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