培养基配制010概要Word格式.docx
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本次实验做100ml10x(稀释后可制成1升培养基,可用于33个培养皿)
KNO3
2.830g
CaCl2·
2H2O
0.166g
MgSO4·
7H2O
0.135g
KH2PO4
0.400g
(NH4)2SO4
0.463g
注:
配制时按表中所列顺序逐一添加,每种成分溶解后再溶解另外一种成分。
1)B5微量母液:
(母液II,第一组)
1000ml(100X倍)含
KI
0.0750g
H3BO3
0.3000g
MnSO4·
H2O
1.0000g
ZnSO4·
0.2000g
Na2MoO4·
0.0250g
CuSO4·
5H2O
0.0025g
CoCl2·
6H2O
本次实验各试剂用量过少,精确度不够,可全班做100ml。
天平用万分之一天平(十教649)。
稀释后可供100升培养基配制
2)B5有机母液(每种试剂,单独一个试管盛放,):
(母液III浓度,第二组,用于30个培养基的制作)
烟酸(VB3,Nicotinicacid,单独试管盛放)
0.001g/ml(每班0.002g,加入2ml蒸馏水,可制作60个培养基)(100毫升培养基需要0.1毫升,)
盐酸吡哆醇(VB6,单独试管盛放)
0.001g/ml(每班0.002g,加入2ml蒸馏水,可制作60个培养基)(100毫升培养基需要0.1毫升)
盐酸硫胺素(VB1,单独试管盛放)
0.010g/ml(每班0.002g,加入2ml蒸馏水,可制作60个培养基)(100毫升培养基需要0.1毫升)
肌醇(myo-Inositol,,单独试管盛放)
0.010g/ml(每班称取0.2g,加入20ml蒸馏水,可制作60个培养基)
4)铁盐:
(母液IV,第三组)
本次实验做:
100ml(100X倍)
FeSO4·
0.278g
Na2EDTA·
0.373g
配制顺序如下
1.称取0.278gFeSO4·
7H2O溶解于20ml去离子水中(A)。
2.称取0.373gNa2-EDTA·
2H2O溶解于20ml去离子水中(B)。
3.将A置于70℃水浴锅中直至溶质完全溶解(C)。
4.将A倒入C中混合,置于70℃水浴锅中保温2h(小时)。
5.定容至100ml。
5)激素(第四组)
激素
溶解方法
母液浓度
6-BA
加稀碱溶解(1MNaOH),再用蒸馏水定容
1mg/ml
NAA
加碱溶解(1MNaOH),再用蒸馏水定容
2,4-D
加少量酒精溶解,再用蒸馏水定容(每班称取0.0050g,加入20毫升蒸馏水,可配置60个培养皿)
0.00025mg/ml
培养基配置及灭菌(10-13)
移液器的使用
实验步骤:
1.灭菌,晾凉:
培养皿、蒸馏水(开、关盖子)后,培养皿烘干。
2.(2-3小时)培养基配制:
母液称量、添加琼脂、调节pH、导入三角瓶(100ml培养基),灭菌,凉到50-60度左右,摇匀,分别注入培养皿(培养皿的一半,要厚,提供营养,一半3个培养皿需要100ml)
3.超净台风干后,保鲜膜包装,放入4度冰箱,可挑选一培养皿(包好)放于28度,进行污染观察。
准备的药品()
(第一组)2,4-D加少量酒精溶解,再用蒸馏水定容0.25mg/ml10ml
(第三组)1NNaOH(1~4N4g溶于100ml水中)
(第三组)1NHCl(1~4N8.3ml溶于91.7ml水中)
(第一组)70%酒精(70ml酒精溶于30ml水)
(一)培养基配方
每3个培养基配100毫升培养液,分别放到三角瓶里,灭菌后,报纸封口,
每100毫升含有:
母液I:
N6大量元素(10x,):
10ml
母液II(B5微量):
1ml
铁盐:
烟酸:
0.1ml
盐酸吡哆醇:
盐酸硫胺素:
肌醇:
L-proline脯氨酸:
0.28g
蔗糖:
3g
CH(Caseinacidhydrolysate)络氨酸:
0.03g
2,4-D:
Phytagel:
0.7g(1g的琼脂条)
PH值:
5.8(~6)
(二)培养基配置
(1)在配置培养基时取适量(配置培养基总量的2/3左右)的蒸馏水放入容器内。
(2)把容器放在电磁炉或者水浴锅上加热,同时加入剪断的琼脂条。
(3)不停搅拌,防止粘锅,同时加速溶解。
(4)按量称取蔗糖并加入,同时搅拌。
(5)待琼脂条、蔗糖完全溶解后加入母液Ⅰ(N6大量元素)、母液Ⅱ(B5微量元素)(80℃左右),然后搅拌均匀。
(6)加入铁盐母液IV。
(7)待培养基冷却至50-60℃时加入有机成分,到培养基达到40℃时加入激素(2,4-D)。
(8)加入蒸馏水定容到量(按照10个培养基计算,300ml),测定pH值,用0.1mol/LNaOH或HCL将培养基的pH调至所需数值(PH=6.0左右)。
(9)清洗培养瓶、培养盖,沥干水份。
(10)用分装器将培养基分装到三角瓶(1L不用分装)中,趁热分装。
分装时注意不要将培养基溅到容器壁口,以免引起污染。
分装量根据培养材料不同而异,每瓶装入100ml(250ml三角瓶)。
11)选用合适的封口材料包扎好瓶口或盖上瓶盖。
12)在培养基瓶上贴上标签或用记号笔在瓶壁上注明培养基的代号、配制时间等,以免混淆。
然后用塑料周转筐运至灭菌室准备灭菌。
13)同时对实验时所需要的解剖刀、解剖针、纱布、镊子、无菌水灯放入高压灭菌锅内灭菌。
(灭菌步骤附后)
14)超净台酒精擦拭,开uv,风,放入灭好菌的三角瓶和培养皿,将培养基倒入培养皿中。
15)培养基冷却、风干后,包好放入4度冰箱备用。
(三)高压灭菌操作步骤
1)首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。
2)放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤,以免蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
3)加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。
4)加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。
待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。
当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间(121摄氏度/15-20分钟)。
5)灭菌所需时间到后,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。
如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染
注意:
1、锅内加的水一定要为去离子水,以避免锅底水垢产生。
2、锅内的水一定要没过底部平板,以防甘烧。
3、每次灭菌之前都要检查灭菌的时间温度设置。
4灭菌完毕压力未降至0时,千万不要随意打开顶盖。
(四)超净工作台
1.实验前将紫外灯开启20min以上。
2.用棉球蘸取70%酒精将超净工作台整个空间擦拭一遍。
3.进行无菌操作时,动作尽量轻柔,时刻保持无菌意识。
4.冷却至50-60度的培养基导入预先准备好的培养皿(20-30ml)中。
5.培养基过夜风干后,保鲜膜包裹,4度冰箱备用
(五)无菌室
无菌室应定期(每星期)用70%酒精或84消毒液消毒,配合紫外线灭菌灯每次开启20分钟以上,以使无菌室经常保持高度的无菌状态。
外植体灭菌与接种(10-13)
准备物品:
酒精灯,
1.(3小时)提前灭菌:
50ml离心管、蒸馏水(500ml广口瓶放入800ml水)、滤纸(锡箔纸包裹)等
2.提前准备:
种子去壳、70%酒精,次氯酸钠,锡箔纸,酒精灯、镊子、支架等
3.(3小时)种子消毒:
70%酒精,次氯酸钠,灭菌水清洗、种子放于滤纸上晾干。
4.(1小时)接种:
用镊子(每次夹取种子前火焰灼烧)
溶液配制
30%次氯酸钠溶液:
VNaClO:
VH2O=1:
2
70%酒精:
稀释100%或95%的乙醇至70%
水稻(日本晴)愈伤组织的诱导(以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织)
1.消毒:
取水稻成熟种子,人工或者机械脱壳,挑选饱满光洁无菌斑的种子,按以下步骤消毒:
1)蒸馏水清洗
2)将种子放入30ml无菌50ml离心管中,倒入70%酒精消毒1分钟;
2)倒去酒精,加入30ml30%次氯酸钠(NaClO)溶液(5.2%次氯酸钠),浸泡30分钟;
3)倒去次氯酸钠溶液,用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍(每次10分钟),最后一遍浸泡30分钟。
2.诱导与继代培养:
(以下步骤需无菌操作)
1)种子放在无菌滤纸上吸干,置成熟胚于诱导培养基中,每皿12额外10-14颗;
3)操作完毕用封口膜(MicroporeTMSurgicalTape)封好培养皿,在30℃光照培养箱,
4)培养4周;
5)在超净工作台上打开培养皿,用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织(淡黄色,致密呈球状),在30℃光照培养箱,继代培养1-2周。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天,次数多了效果会减弱)
实验四:
愈伤组织继代培养
每0.1升可以配制3-4个培养皿的培养基:
N6大量元素(10X):
B5微量(100X):
铁盐(100x):
L-GluL-Glutamine:
0.05g
L-pro:
CH:
2,4-D
0.8ml
蔗糖
0.40g(琼脂条1g)
5.8
粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基(每升含量):
N6大量元素(20x):
50ml
B5微量(100x):
1ml
0.5g
2.8g
0.3g
8ml
30g
4.0g
实验六:
诱导长芽(14)
挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中,用封口膜封好,放入恒温培养室中,等待分化成苗(30-60天)。
苗长至1cm左右,放入生根培养基中壮苗。
分化过程中不可将愈伤继代培养。
以上操作步骤皆在无菌条件下进行。
粳稻分化培养基配方(每升含量):
N6大量元素:
B5微量:
铁盐:
L-Glu:
6-BA:
3ml
0.5ml
蔗糖:
Agar
8g
5.8
实验七:
诱导生根(15)
6)粳稻生根培养基配方(每升含量):
25ml
5ml
0.5ml
20g
agar:
8.0g
pH5.8
实验八:
移栽驯化(16)
锻炼和移栽
转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。
将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出(苗长至试管顶部,就要及时开盖),打开封口膜,加入适量无菌水(防止培养基长菌),炼苗3天至一周左右,然后洗去琼脂,移栽到温室的土钵中生长,检测。
水稻苗期水培营养液配方:
Macro-nutrientsolution(mM)
元素
终浓度
使用盐类
分子量(g/mol)
母液(ⅹ103)用量(g/L)
N
2.5
(1.25mM)NH4NO3
80.04
100
P
0.3
136.09
40.83
K
1
(0.35mM)K2SO4
174
60.9
Ca
147
Mg
246.5
SiO2
0.5
Na2SiO3·
9H2O
284.2
142.1
Micro-nutrientsolution(µ
M)
Mn
9
MnCl2·
4H2O
197.92
1.781
Mo
0.39
241.95
0.0944
B
20
61.83
1.2366
Zn
0.77
287.56
0.2214
Cu
0.32
249.68
0.0799
Fe
7H2O+Na2_EDTA
278.02
5.57
注:
2.制备大量元素营养液母液时,各种盐类分别溶解,分别储存,使用时每升营养液加1mL母液。
3.制备微量元素营养液(除Fe外)时,先放500mL去离子水,称取各种盐类逐一溶解后,入容量瓶加蒸馏水稀释至1L,制成母液,使用时每升营养液加1mL母液。
4.Fe的制备:
溶解5.57gFeSO4·
7H2O于200mL蒸馏水,再另溶解7.45gNa2-EDTA200mL蒸馏水中,加热Na2-EDTA(大约70度),加入FeSO4·
7H2O,不断搅拌,然后于70度恒温箱中螯合2h,冷却定容至1L,储于棕色瓶中,使用时每升营养液加1mL母液。
5.调节pH为5.5。
6.铵营养时,加入硝化抑制剂(双氰胺),每升营养液加2mg双氰胺(终浓度)。
各人配制时,应注意所用的盐类和分子量,检查盐用量准确无误。
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