ADMET工程细胞株的构建调研报告.docx
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ADMET工程细胞株的构建调研报告
中国•南京
ADME/T工程细胞株的构建
调研报告
1药物ADME/T研究的内容1
1.1药物ADME/T性质研究的内容1
1.2药物ADME/T性质研究的必要性1
2药物ADME/T性质体外研究常用的细胞模型5
2.1Caco-2细胞模型6
2.1.1Caco-2细胞模型的基本特点6
2.1.2Caco-2单层细胞模型的建立6
2.1.3Caco-2细胞模型的评价7
2.1.4Caco-2细胞模型在口服药物吸收及机制研究方面的应用8
2.1.5Caco-2细胞模型在药物吸收机制研究方面的优缺点9
2.2MDCK细胞模型9
2.2.1MDCK细胞模型的基本特点9
2.2.2MDCK单层细胞模型的建立11
2.2.3MDCK单层细胞模型的评价11
2.2.4MDCK细胞模型在药物研究中的应用12
2.3LLC-PK1细胞模型的基本特点及其应用13
2.4ADME/T细胞模型在我国中药发展中具有重要的作用14
3药物转运体研究技术及其对药物研发的贡献15
3.1药物转运体的概念、分类、功能及组织分布16
3.2药物转运体与药物相互作用研究的指导原则18
4高效表达药物转运体的转基因细胞模型20
4.1药物转运体细胞模型的构建方案21
4.2细胞模型转运体稳定表达的验证方法21
4.3MDCK-MDR1细胞模型的构建及评价23
4.3.1MDCK-MDR1细胞株的构建23
4.3.2MDCK-MDR1细胞株的生物学特征及功能性检测23
4.3.3MDCK-MDR1细胞株建立的意义及应用25
4.4LLC-PK1-BCRP细胞模型的构建及其评价27
4.4.1LLC-PK1-BCRP细胞株的构建27
4.4.2LLC-PK1-BCRP细胞株的生物学特征及功能性检测27
4.4.3LLC-PK1-BCRP细胞株建立的意义及应用29
4.5稳定表达人有机阴、阳离子转运体和有机阴离子转运肽的HEK293细胞株构建及评价30
4.5.1HEK293-OATP1B1细胞株的构建30
4.5.2HEK293-OATP1B1细胞株的生物学特征及功能性检测31
4.6Bcap37-MDR1细胞模型的构建及其评价31
4.6.1Bcap37-MDR1细胞模型的构建31
4.6.2Bcap37-MDR1细胞株的生物学特征及功能性检测32
4.7多种转运体蛋白共表达的转基因细胞模型33
5项目展望(个人看法)34
图目录
图1药物在体内的转运过程1
图2一个新药从研究开发到成功上市的基本过程2
图3药物研发历程中导致失败的原因分析3
图4ADME模型在药物研发过程中角色的转变3
图5ADME/T模型在药物研发中的价值贡献5
图6Caco-2细胞单层模型7
图7中药及中药复方体外ADME/T性质研究的一般思路15
图8SCI收录的关于转运体在药动学/药物相互作用方面的文章数量年年递增16
图9机体主要器官药物转运体的功能及分布16
图10药物转运体细胞模型构建的一般策略21
图11LLC-PK1-BCRP单克隆细胞的活性鉴定——Hoechst33342染色法28
表目录
表1MDCK细胞与Caco-2细胞的比较11
表2ABC转运体家族17
表3SLC转运体家族18
表4药物相互作用研究相关的转运体19
1药物ADME/T研究的概述
药物ADME/T性质研究的内容
药物代谢动力学(Pharmacokinetics)是研究药物的体内过程及体内血浆等组
织药物浓度随时间变化规律的一门学科(图1所示)。
ADME/T是近几年发展起
来的、全新的、在细胞水平上早期进行药物的活性与吸收(Absorption)、分布
(Distribution)、代谢(Metabolism)、清除(Excretion)及毒性(Toxicology)
实验的新型新药研究模式,简称为ADME/T实验系统。
ADME/T药物动力学是当
代药物设计和药物筛选中十分重要的方法。
在药物化学研究中,药物动力学是进
行一系列探索药物ADME性质及其机理的研究工作。
药物的动力学性质在药物开
发和应用中占据着非常重要的地位。
图1药物在体内的转运过程
资料来源:
BD公司网站
药物ADME/T性质研究的必要性
在新药研发和使用过程中,化合物的体内过程(吸收、分布、代谢、排泄)和毒性(ADME/T)是其成药性的重要指标。
在药物设计及新药开发早期就要开展药物代谢研究,有利于提高新药研发的成功率,降低新药开发的成本,有助于获得安全、有效的治疗药物。
因此,化合物ADME/T性质在创新药物转化研究中发挥重要作用并贯穿了整个研发过程,包括应用药物ADME性质设计和优化药物结构;筛选药物ADME活性;体外评价药物ADME性质;应用整体动物体内评价药物ADME性质;预测由药物代谢引起的毒性;指导临床药物ADME研究与个体化用药方案制订等。
新药研发是一个耗时和耗资的过程,从研发到临床使用将近历时十年以上,耗资10亿多美金。
平均而言,每一百万个化合物中最终能被FDA批准上市的只有一个;而上市的药物中,也只有30%的药物能够获得利润,收回其研发成本。
制药公司年收入的20%用在新药的研发上,全球每年在新药上的投资超过300亿美金(图2所示)。
图2一个新药从研究开发到成功上市的基本过程
Compoundnumbers→Cpds
资料来源:
GermanResearchCenterforEnvironmentalHealth
在先导化合物的筛选过程中,40%到60%的先导化合物会在后续的ADME/T性质检测中被淘汰。
导致失败率较高的原因主要有:
商业性占5%;动物实验毒性(Tox.)过大占11%;药效不够占30%;人体副作用过大占10%;药物的ADME性质不佳学占39%(图3所示)。
全球72%的药物研发费用被浪费在日益增长的临床耗费、体内无法预测的调控环境以及药物的毒副作用方面。
图3药物研发历程中导致失败的原因分析
资料来源:
NatureReview
纵观药物发现的漫长历史,药物研究已经经历了由盲目随机的到有的放矢的、有传统经验性的向现代的科学性的研究方法的转变。
90年代药物研究策略主要采用以生物活性为主导的筛选模式,药物研究遵循“分子库——活性筛选——传统QSAR模型——ADME/PK研究——毒性研究——候选药物”的循环过程(按部就班的“循环式”);而如今的药物研究则遵循“分子库——平行筛选(包括活性、ADME/T等)——ADME/T模型——合成分子——平行筛选——候选药物”的平行过程(齐头并进的“平行式”)。
目前,国外制药公司不仅在测定药效的同时平行评价化合物的ADME/T性质,并且建立了体外高通量筛选ADME/T技术(图4所示)。
药物早期ADME/T性质研究主要以人源性或人源化组织功能性蛋白质为“药靶”,体外研究技术与计算机模拟等方法相结合,研究药物与体内生物物理和生物化学屏障因素间的相互作用。
药物早期ADME/T性质评价方法可有效解决种属差异的问题,显著地提高药物研发的成功率,降低药物的开发成本,减少药物毒性和副作用的发生,并能指导临床合理用药。
数据显示,随着新策略和新技术的应用,因ADME/T问题而终止新药开发的比例下
下降为11%。
图4ADME模型在药物研发过程中角色的转变
资料来源:
NatureReview
药物开发开始于先导药物的发现,而具有发展前景的先导化合物必须具备一系列条件:
结构简单、可以进行修饰和改造、可归纳于已知的构效关系中、易于专利化和良好的ADME/T特性。
因此,选出优良品质的先导化合物是药物筛选的一个至关重要的过程。
如今世界各大制药公司在药物开发的早期都会收集尽可能多的关于靶点、待测化合物性质、以及现有筛选方法手段优劣性的信息,以确保尽快剔出阴性化合物,拿到优良品质的先导化合物。
对于一个药物,除了它的活性以外,其ADME/T性质也是决定它应用于临床成功与否的关键(图5所示)。
目前世界公认的新药研发三大平台包括药效学平台、药物代谢动力学平台以及安全评价学平台。
随着基因组学和化学合成技术(组合化学)的发展,当代药物探索(Drugdiscovery)研究要求采用高通量实验方法和以人源性的细胞和组织而非动物模型进行药物ADME/T性质的评价。
面对浩如烟渺的组合化学分子库,建立高通量药物筛选(HTS)模型和ADME筛选模型显得尤为重要。
特别是在人的细胞和组织水平上建立ADME模型,有利于快速便利地高通量检测药物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程,建立起药物及化合物的ADME活性数据库。
在此基础上,利用计算化学和药物设计方法建立有关药物的吸收、分布、代谢和排泄的理论模型,并用于预测药物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)、药物——药物相互作用、细胞毒性和安全性等,进一步指导合理的药物设计。
这样能够大大提高创新药物研究开发的效率,缩短周期,减少成本,降低风险。
图5ADME/T模型在药物研发中的价值贡献
资料来源:
IMSInstitute
传统的药物动力学研究模式已经不能适应现代药物研究的要求,体外高通量ADME/T结合计算机方法称为当今药物研究发展的趋势。
ADME/T构成了当代药物化学研究十分重要的方面,并逐渐成为当代药物发现策略的一部分。
诚如Selick教授所言:
“药物的ADME/T性质将是今后药物设计的首要原则中不可或缺的组成部分”。
2药物ADME/T性质体外研究常用的细胞模型
目前,一个新药进入市场并不是十分有效的过程,其中90%以上已经进入临床研究的药物最终由于药代动力学和药效学因素(如生物利用度差、异常毒性、安全性评价不当以及药物相互作用等)而功亏一篑。
导致新药发现如此低的成功率的一个重要原因与药物发现和开发阶段的动物实验数据相关。
由于在生理和致病过程中存在着种属间差异性,因此,在药物开发过程中使用的实验动物往往是不可靠的,会给我们提供大量错误的信息。
对于这样的情况,人们已开发出基于人体细胞和组织的体外筛选法包括高通量筛选(HTS)和ADME/T进行药物代谢研究,这对预测临床前药物的ADME/T性质和安全性是十分重要的。
ADME/T细胞培养模型能在一定程度上模拟体内条件而被广泛用在多种给
药系统中进行药物吸收机制及转运途径等方面的研究,尤其是对蛋白质、多肽
等生物大分子药物及微粒制剂的评价,这对从细胞水平揭示药物和制剂与机体的作用机制以及指导给药系统的改善具有重要意义。
ADME/T细胞培养模型有利于探讨药物动力学和结构的定量构效关系的特点;有高通量、节省时间、节省资金并有利于对组合代谢产物进行分析的特点。
经过20多年的发展,目前已有很多基于组织水平和细胞水平的ADME/T体外模型用于药物高通量的研究,比较成熟的有用于药物吸收研究的Caco-2细胞模型、用于代谢研究的肝细胞或肝微粒体模型、用于药物分布研究的药物——血浆蛋白结合模型和透血脑屏障模型等。
Caco-2细胞模型
目前广泛应用的肠渗透模型主要有Caco-2和MDCK细胞系,也是可以实现大量、快速筛选药物的方法之一。
其中,Caco-2细胞系来源于人类结肠腺癌,Caco-2细胞单层转运模型是ADME/T的典型方法之一,也是被美国FDA批准的一个药物吸收模型。
Caco-2细胞模型的基本特点
Caco-2细胞在普通培养条件下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自发的分化为肠上皮细胞单层,因此可以模拟体内小肠上皮细胞层。
Caco-2细胞具有与小肠上皮细胞相同的极性及紧密连接,在肠腔侧分化出的绒毛膜面含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质转运载体。
研究表明I相代谢酶CYP1A1及II相代谢酶谷胱甘肽S-转移酶、B-葡糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶在Caco-2细胞中也存在,并保持P-糖蛋白高表达的特征。
由于其形态学及生化性质都与小肠上皮很相似,Caco-2细胞模型已广泛应用于体外药物分子肠吸收的研究。
Caco-2单层细胞模型的建立
Caco-2细胞培养于T75培养瓶中,培养液为DMEM,其中含胎牛血清、非必需氨基酸及青-链霉素双抗,在37℃、5%CO2的培养箱中培养待用。
当Caco-2细胞传至20-30代时,将细胞接种在Transwell板的滤膜上,细胞接种密度为0.8×105-4×105个/mL。
在Transwell滤膜的顶端(apicalside,AP)和底端(basolateralside,BL)分别加入培养液。
将细胞置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,接种24h后更换培养液,前一周隔天换液,一周后每天换液,培养14-21d(图6所示)。
图6Caco-2细胞单层模型
资料来源:
DrugDiscoveryToday
Caco-2单层细胞模型的评价
用细胞单层模型进行药物转运研究时,必须对细胞单层的完整性及药物转运蛋白的功能进行检查和评估,以保证实验结果的可重复性。
FDA也对此制定了相关指南,对接种Caco-2细胞的密度、单层细胞的跨膜电阻值、标志物被动扩散的跨膜通量等几方面都做了具体说明,该指南还指出可以使用14C标记的甘露醇作为标志物评估细胞单层的完整性。
总结起来,共有以下5个指标验证其完整性:
(1)用电子显微镜或光学倒置显微镜进行形态学上的检查,要求细胞生长均匀,边界清晰,具有小肠微绒毛结构和细胞间紧密连接;
(2)测定小肠刷状缘细胞标志酶——碱性磷酸酶的活性,以确定细胞极性的生成,要求它主要集中于AP侧;(3)跨膜电阻(transepitheliumelectricalresistance,TEER)的测定,以确定细胞单层的完整性和紧密性。
细胞培育14-21d,单层的跨膜电阻为200-700Ω/cm2左右,此时Caco-2细胞单层对漏出标志物是不渗透的,可以在这段时间进行药物的摄取或跨膜转运实验;(4)用辣根过氧化物酶测定其胞饮功能。
(5)通透性的测定,通常用荧光素钠、普萘洛尔、甘露醇、荧光黄菊粉、聚乙二醇4000等标记物检测其被动扩散跨膜通量。
Caco-2细胞模型在口服药物吸收及机制研究方面的应用
Caco-2细胞模型是目前最好的体外吸收模型,是阐明药物吸收机制的有力工具。
作为药物吸收研究的一种快速筛选工具,Caco-2细胞模型能够在细胞水平评估新药的粘膜渗透性及阐明药物的转运途径。
特别是在中国传统药物的研究方面,由于大部分中药的具体吸收成分和机制还未明确,因此,Caco-2细胞模型在中药口服吸收研究方面具有广泛的应用前景。
归纳起来,Caco-2细胞模型的应用主要有以下方面:
(1)Caco-2细胞模型在药物吸收改善研究中的应用,主要包括:
研究药物结构——吸收转运关系;预测药物的体内吸收;评价前体药物的口服吸收;研究药物剂型对吸收的影响;确定药物在肠腔吸收的最适pH值。
(2)Caco-2细胞模型在药物吸收机制研究中的应用,主要包括:
药物被动转运的研究;载体介导主动转运的研究;药物外排机制的研究。
(3)Caco-2细胞模型在中药吸收研究方面的应用。
Caco-2细胞模型在中药吸收方面研究的热点目前主要集中在对黄酮类化合物及生物碱吸收机制的研究,在强心苷、香豆素、皂苷及萜类化合物的研究也有报道。
(4)Caco-2细胞模型在药物代谢方面的应用。
已有研究证实在Caco-2细胞中存在CYP3A样活性酶及CYP1A1,因此,Caco-2细胞可作为药物分子在小肠上皮氧化代谢研究的模型。
另外,Caco-2细胞同时存在着P-gp、MRP外排系统及细胞色素P450同工酶(与人类小肠上皮一致),人们可以利用这一模型研究氧化代谢与外排作用在限制药物口服生物利用度方面的关系。
Caco-2细胞也表达与人类小肠上皮细胞相关的磺基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶、B-葡糖醛酸糖苷酶。
药物的II相结合反应同样影响药物的吸收反应。
因此,Caco-2细胞模型同样可作为药物分子在小肠上皮II相代谢研究的有效工具。
另有研究表明转染某些特定代谢酶cDNA将大大提高Caco-2细胞代谢酶的表达,这也促进了Caco-2细胞模型在代谢研究方面的作用。
Caco-2细胞模型在药物吸收机制研究方面的优缺点
Caco-2细胞模型作为药物吸收研究的一种快速筛选工具,具有一系列的优点:
能够在细胞及分子水平提供关于药物分子通过小肠粘膜的吸收、代谢、转运的信息;细胞分化的极性有助于研究药物双方向(肠腔侧→肠壁侧或肠壁侧→肠腔侧)的转运率,从而对主动转运的药物进行研究;各种转运系统及代谢酶在Caco-2细胞中都有表达,使该模型的研究结果与体内药物的处置有很好的相关性;Caco-2细胞来源于人体,因而不会造成各种药动学性质的种属差异,其结果有较好的重现性;Caco-2细胞模型的实验条件,如转运介质的pH值及药物浓度比较容易控制。
Caco-2细胞模型的局限性在于:
分化的Caco-2细胞单层中的紧密连接比在小肠上皮细胞中更具特征性,其TEER值比正常小肠上皮细胞高;Caco-2细胞由于缺乏分泌粘液的杯状细胞,因而缺乏小肠上皮中的粘液层;Caco-2细胞中某些特别的酶(细胞色素P450的一些同工酶)的活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gp在Caco-2细胞中表达的波动性对结果都有不同程度的影响;Caco-2细胞的吸收转运体表达量相较于小肠上皮细胞要低,因而在主动转运药物的研究方面欠佳。
MDCK细胞模型
马丁达比狗肾细胞系(Madin-DarbyCanineKidney,MDCK)是Madins.H.和DartiyN.B.于1958年9月从一成年克卡犬的肾脏取得的,属于肾远曲小管上皮细胞,是一种单层生长的可传代的细胞系。
MDCK细胞模型是研究肾远曲小管生理、生化过程的最佳工具,也是了解药物在肾远曲小管转运的理想模型。
该细胞模型具有易取得、经济、培养周期短等特点。
MDCK细胞模型的基本特点
早在1998年Rothen-RutishauserB等就发现MDCK细胞在半透膜上培养,可分化成极性的柱状上皮并形成刷状缘,相邻细胞间连接紧密(tightjunction,TJ),形成完整的细胞单层(cellmonolayer)。
以细胞单层为一个整体测得的跨上皮电阻TEER是评价细胞间紧密连接程度和屏障功能的主要指标。
TEER越大,表明细胞间连接越致密,屏障功能越强,对物质的通透性越低。
根据MDCK细胞传代次数的不同,可将其分为两类:
MDCKI和MDCKII。
MDCKI为早期传代获得的细胞株,MDCKII为后期传代获得的细胞株,它们之间最大的区别在于TJ的不同。
通常MDCKI的TEER远高于MDCKII的TEER,MDCKII中各种酶的活性,如碱性磷酸酶、Na+/K+-ATP酶与γ-谷氨酰胺转移酶均较MDCKI高。
MDCKII细胞株较MDCKI更接近人正常细胞的生理特征,广泛应用于生命科学领域的研究。
与Caco-2细胞类似,MDCKII细胞在聚碳酯膜上培养也可分化为类似小肠上皮细胞的单层膜结构,如刷状缘与细胞紧密连接等。
由于MDCKII不来源于肠道上皮组织且其传代次数较高从而丧失了部分原代细胞特征,生化特性检查发现其缺乏Caco-2细胞中表达的大部分代谢酶、摄取转运体与外排转运体。
利用MDCKII细胞的这些特征,可以将某些特定酶或转运体的cDNA导入MDCKII细胞中,得到持续稳定表达该酶或转运体并具有遗传特性的转基因MDCKII细胞株。
得到的转基因细胞株由于专一表达导入的酶或转运载体,可以避免其他类似功能酶或载体对研究的干扰。
如Troutman等通过Western印迹法定量分析了MDCK、MDCK-MDR1、Caco-2细胞模型以及来自同一志愿者十二指肠、空肠、回肠等细胞匀浆中P-gp的表达量,发现MDCK-MDR1细胞模型的P-gp表达量介于十二指肠、回肠和空肠的表达量之间,比Caco-2细胞的表达量略多。
说明MDCK细胞能很好的模拟肠道吸收。
又因其来源于肾远曲小管的上皮细胞,故在模拟肾小管功能时具有很大优势。
尽管MDCK细胞模型具有体外细胞模型的一些通病,如缺少相似的生理环境,无细胞异质性,缺少部分酶类等;但是MDCK细胞模型作为研究药物转运和代谢的体外模型,有其独特的优点:
(1)细胞培养周期短,MDCK细胞自接种开始,达到稳定融合期一般只需5-6d,从而减少了试验成本,降低染菌的可能性,且平均每周至少能进行一次转运实验;
(2)与Caco-2模型比较具有转运蛋白表达的种类少、水平低,酶代谢活性低等特点;(3)易于培养,无需特殊细胞培养条件。
MDCK细胞与Caco-2细胞的不同之处详见表1。
资料来源:
药理学报
表1MDCK细胞与Caco-2细胞的比较
项目
Caco-2细胞
MDCK细胞
来源
人结肠腺癌
狗肾上皮细胞
培养周期
21d
3-5d
主要转运体
P-gp,葡萄糖,氨基酸,维生素,肽类,核苷酸和一元羧酸
一元羧酸,二肽,P-gp和阳离子肽类等
优点
来源于人,表达部分转运蛋白和酶
培养周期短,TEER值与人体小肠相近,试验结果重现性较好
缺点
缺少黏液层,紧密连接过紧,表达的酶与小肠有差异;培养周期长
表达转运蛋白水平低,代谢活性低,来源于动物
主要应用
主动转运,被动转运
被动转运
MDCK单层细胞模型的建立
MDCK细胞培养于T75培养瓶中,培养液为含10%FBS的MEM,在37℃、5%CO2的培养箱中培养待用。
约3-5d细胞融合达90%后传代,用37℃预热的消化液(0.25%胰酶&0.02%EDTA)室温下消化,传代细胞密度1.5×105个/瓶。
细胞接种24h后更换培养液。
待细胞长满后,将细胞以(0.5-5.0)×106/cm2密度接种至Transwell的聚碳酸酯微孔滤膜上。
培养过程中用电阻仪定期测量单层细胞的电阻TEER。
MDCK细胞单层模型一般需要3-4d的培养,电阻才能达到稳态。
根据TEER确定细胞模型完整度是否满足转运实验要求。
MDCK单层细胞模型的评价
为了确定MDCK单层细胞的完整性,可以从四个方面指标判断:
(1)细胞形态观察。
用倒置相差显微镜每天观测MDCK的生长情况及培养液情况(颜色、澄清度);
(2)细胞生长曲线的绘制。
观察MDCK细胞的生长状态,细胞计数法绘制生长曲线,以便了解MDCK细胞生长特征,提供体外转运试验可靠依据;(3)细胞单层TEER的测定;(4)通透性的测定,通常采用荧光素钠、甘露醇、荧光黄菊粉、聚乙二醇等标记物检测其被动扩散跨膜通量。
MDCK细胞模型在药物研究中的应用
MDCK细胞系自20世纪50年代建立开始,经过几十年的探索,已被大多数人认可。
作为药物体外筛选模型,主要有以下几个方面的应用:
(1)肠道吸收模型。
基于MDCK细胞模型的特性和优势,该细胞模型作为
肠道吸收模型而应用于实验研究。
MDCK细胞可以转染多种异源基因,从而实现对基因表达产物在药物吸收中所起作用的研究。
HeL等利用MDCK-MDR1细胞模型研究防己诺林碱对紫杉醇双向转运的调节作用,发现防己诺林碱能明显减少紫杉醇的外排,并抑制P-gp介导的抗癌药物的多药耐药作用。
GuoAllan等将MDCK细胞分别转染P-gp、多药耐药相关蛋白1(multidrugresistanee-associatedprotein,MRP1)、多药耐药相关蛋白2(multidrugresistanee-associatedprote
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