金刚烷胺衍生物的设计合成及其抗禽流感病毒活性.docx
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金刚烷胺衍生物的设计合成及其抗禽流感病毒活性
金刚烷胺衍生物的设计合成及其抗禽流感病毒活性
黎万,吕露,屈洁,潘薇,吴叔文,杨健
(武汉大学药学院,湖北武汉430072;2.武汉大学生命科学院)
摘要:
目的设计合成金刚烷胺衍生物并对其进行抗禽流感病毒活性测试方法以金刚烷甲酰氯和氨基酸甲酯盐酸盐为起始原料,经酰胺化水解成盐等反应依次得到3个系列金刚烷胺衍生物以金刚烷胺为阳性对照,采用幼犬肾(MDCK)细胞系噬斑形成实验测定目标化合物的抗禽流感病毒活性结果与结论共合成了20个未见报道的新化合物,目标化合物的结构均经1H-NMRIRMS谱确证;仅有化合物A5显示出较好的抗禽流感病毒活性
关键词:
化学合成;金刚烷胺衍生物;抗禽流感病毒
自1997年人类第一例感染禽流感病毒H5N1死亡病例报道以来,截至2006年3月该流感病毒已在中国越南泰国等7个国家蔓延,据报道,176例感染H5N1型禽流感病毒患者中至少97人死亡,死亡率为55%,该病毒具有高致病性和高死亡率的特点.目前我国流行的A型高致病禽流感病毒为H5N1亚型,而抗流感病毒药物发展缓慢,有效药物品种较少.众所周知,金刚烷胺是目前治疗流感的有效药物,但由于该药易产生耐药性,使其应用受到限制[1]已有文献报道金刚烷胺的某些衍生物也具有一定的抗流感病毒活性,如金刚烷酸的羧基经酰胺化后其抗病毒活性明显提高,比金刚烷胺强;金刚烷酸氨化物的抗Sindbis病毒活性比金刚烷乙胺强,研究显示,这可能与它抑制病毒蛋白质和RNA的合成有关,提示金刚烷酸通过氨基酸化能增强其抗病毒活性[1-3]基于上述研究成果,本文作者对金刚烷酸的结构做进一步修饰,通过引入不同的氨基酸成酯成盐等反应,设计合成了3个系列的新金刚烷胺衍生物,并进行了抗禽流感病毒活性实验,以期从金刚烷胺新衍生物中筛选出高效低毒的抗禽流感病毒先导化合物作从增加衍生物的水溶性降低毒性和增强活性的思路出发,以金刚烷甲酰氯和氨基酸甲酯盐酸盐为起始原料,经酰胺化水解成盐等反应依次得到3个系列20个未见报道的新化合物,目标化合物的合成路线见图1
1实验部分
实验使用仪器:
RE52-86A旋转蒸发仪;SHZ-型循环水真空泵;DF-101S集热式恒温;加热磁力搅拌器;XT-4显微熔点仪;Bruker-400型核磁共振仪(TMS为内标);ThermoNico-letNeXUS470FT-IR傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片);AgilentTechnologlesMSD,Trap-SL型质谱仪所有溶剂均为化学纯。
1.1氨基酸甲酯盐酸盐的合成通法
将各种氨基酸溶解于甲醇中,缓慢通入氯化氢气体,剧烈搅拌并在冰浴条件下冷却,于0℃下搅拌反应2h待混悬液转变成透明溶液后,室温下搅拌6~7h,蒸干溶剂,粗品用无水乙醚洗涤,真空干燥,即得到各种氨基酸甲酯盐酸盐,收率大于99%。
1.2二-1-金刚烷甲酰胺(A1)的合成
参照文献[3]报道的合成方法,于0℃,将1-金刚烷胺0.76g(5.02mmol)和1.20mL吡啶(14.9mmol)的二氯甲烷溶液(15.0mL),在氮气保护下滴加到1.10g(5.53mmol)1-金刚烷酰氯的二氯甲烷溶液(20.0mL)中,剧烈搅拌,将反应物在冰浴中搅拌30min,再在室温下搅拌2h反应物依次用10mL盐酸(3.2molL-1)10mL水10mL食盐水洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,旋干溶剂,粗品用二氯甲烷重结晶得到白色固体A1(0.38g),收率24%,mp>300℃
1.32-(1-金刚烷甲酰胺)-2-苯基乙酸甲酯(A2)的合成
参照文献[4]报道的合成方法,在氮气保护下,将盐酸苯甘氨酸甲酯0.30g(1.49mmol)溶解于无水二氯甲烷(10mL)中,加入无水三乙胺0.43mL(2.97mmol),将所得溶液滴加到1-金刚烷酰氯0.33g(1.64mmol)的无水二氯甲烷(10mL)溶液中,同时在冰浴中冷却滴毕,所得悬浮液依次在0℃搅拌30min,室温下搅拌1.5h混合物用食盐水(10mL×3)和水(10mL)洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,再真空干燥,得到白色固体;粗品经柱色谱(石油醚乙酸乙酯,体积比7∶3)纯化,得到白色晶体A2(0.33g),收率67%,mp140.0~141.0℃同法合成2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-乙酸甲酯(A3)L-2-(1-金刚烷甲酰胺)-3-(1H-吲哚-3-亚基)丙酸甲酯(A4)
1.42-(1-金刚烷甲酰胺)-2-丙酸甲酯(A5)的合成
在氮气保护下,将2-氨基-2-丙酸乙酯盐酸盐0.30g(2.15mmol)溶解于10mL无水二氯甲烷中,加入无水三乙胺0.62mL(4.30mmol),滴加含1-金刚烷酰氯0.43g(2.16mmol)的无水二氯甲烷(10mL)的溶液,冰浴冷却所得悬浮液在0℃下搅拌30min,室温下搅拌1.5h混合物用食盐水(10mL×3)和水(10mL)洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,真空干燥得到白色固体;粗品经柱色谱纯化得到吸湿性晶体A5(0.47g),收率82%,mp102.0~103.0℃同法合成目标物D-2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-(4-羟苯基)乙酸甲酯(A6)D-2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-(4-氯苯基)乙酸甲酯(A7)2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-甲基丙酸甲酯(A8)2-(1-金刚烷甲酰胺)-3-羟基丙酸甲酯(A9)
1.5L-2-(1-金刚烷甲酰胺)-3-(1-金刚烷甲酰基)巯基丙酸甲酯(A10)的合成
在氮气保护下,将2-氨基-3-巯基丙酸甲酯盐酸盐0.49g(2.48mmol)溶解于10mL无水二氯甲烷中,加入无水三乙胺0.72mL(4.96mmol),滴加含1-金刚烷酰氯1.00g(5.0mmol)的无水二氯甲烷(20mL)的溶液,冰浴冷却所得悬浮液在0℃下搅拌30min,室温下搅拌1.5h混合物用食盐水(10mL×3)和水(10mL)洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,真空干燥得到白色固体;粗品经柱色谱纯化得到吸湿性晶体A10(0.88g),收率77%,mp82.0~83.0℃。
1.62-(1-金刚烷甲酰胺)-2-甲基丙酸(B1)的合成
参照文献[5]的合成方法,在0℃,将2.5mL的氢氧化钠溶液(0.08g,1.93mmol)滴加到含0.54g(1.93mmol)2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-甲基丙酸甲酯(A8)的甲醇-四氢呋喃(体积比1∶1)溶液中,搅拌过夜将反应液转移到真空干燥箱中,干燥用6molL-1盐酸调pH值为2.0~3.0,乙酸乙酯(15mL×3)萃取,有机层用无水硫酸钠干燥,真空干燥,粗品经柱色谱(石油醚-乙酸乙
酯,体积比7∶3)分离得白色晶体B1(0.35g),收率69%,mp212~214℃同法由化合物A5合成目标物2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-丙酸(B2)
1.71-金刚烷甲酸乙酯(B3)的合成
将0.30g(1.66mmol)1-金刚烷酸加入到20mL稍过量的无水乙醇中,氮气保护下向其中滴加1mL催化量的浓硫酸,5min内滴加完毕,反应物回流4h用水迅速冷却,乙酸乙酯(20mL×3)萃取,连续用质量分数为5%碳酸氢钠溶液(20mL)和水(20mL×2)洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,所得油状物粗品经柱色谱(石油醚-乙酸乙酯,体积比8∶2)分离得到无色油状物B3(0.32g),收率92%
1.82-(1-金刚烷甲酰胺)-2-乙酸(B4)的合成
参照文献[6-7]报道的方法,将0.44g(1.66mmol)A3溶解于3mLTHF中,加入3mL氢氧化锂(0.12g,2.90mmol)水溶液,室温搅拌过夜反应液用6molL-1盐酸调pH值为2.0~3.0,乙酸乙酯(15mL×3)萃取,有机层用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,所得粗品经柱色谱(石油醚-乙酸乙酯,体积比7∶3)分离得到白色固体B4(0.37g),收率95%,mp182~184℃同法由化合物A2合成目标化合物2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-苯基乙酸(B5)
1.92-(1-金刚烷甲酰胺)-2-甲基丙酸钠(C1)的合成
将200mg(0.753mmol)B1溶解于5mL无水乙醇中,向其中滴加氢氧化钠(30.2mg,0.753mmol)的乙醇(5mL)溶液,混合物在35℃下搅拌过夜将反应液转移至真空干燥箱中干燥,得到白色固体C1(210mg),收率97%,mp292~294℃同法分别由化合物B4B2B5以及金刚烷酸制得化合物2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-乙酸钠(C2)2-(1金刚烷甲酰胺)-2-丙酸钠(C3)2-(1-金刚烷甲酰胺)-2-苯基乙酸钠(C4)1-金刚烷羧酸钠(C5)合成的20个目标化合物的结构经质谱、核磁共振谱、红外光谱确证,化合物的理化常数及波谱
数据见表1表2
2抗禽流感病毒活性
参照文献[8]的实验方法,采用幼犬肾细胞系噬斑形成实验检测目标化合物的活性在幼犬肾细胞(MDCK)培养基内加入不同浓度的药液,将MDCK细胞培养于24孔板中,待细胞长到100%满时,用PBS洗涤2次,按照以下不同方式处理病毒和细胞(每组4个复孔):
阳性对照孔将金刚烷胺(amantadine)与病毒混匀后直接加
入幼犬肾细胞中;病毒感染对照孔将病毒悬液加入MDCK细胞中;细胞对照孔用氨基酸和葡萄糖培养基(DMEM)与细胞孵育;药物处理孔将目标化合物与病毒混匀后直接加入细胞中所用培养基不含血清,加入质量浓度为10mgL-1的胰酶催进感染目标化合物用DMSO配成10gL-1的母液,测定时用DMSO稀释成质量浓度为33.3、6.67、1.33、0.50、0.27、0.05mgL-1,每孔加1L,于37℃感染1h后弃去上清液,用PBS洗涤2次,加入质量分数为2%的无酚红DMEM培养基和质量分数1%琼脂糖混合液(预先融化且于37℃保温以避免凝固),加入质量浓度10mgL-1的胰酶催进感染,正面向上室温放置20~40min,待凝固后倒置于37℃体积分数5%的CO2培养箱培养2~4d待形成的噬斑大
而清晰时,用质量分数0.5%的结晶紫染色,每孔130L,避光染色6~8h后用肉眼计数噬斑数,每孔计数2次,2次结果相同时计数有效,不同时重复计数,直至两次完全相同时记为有效每组的噬斑数为3个孔的平均值化合物对病毒感染的抑制率按下式计算:
抑制率(%)=[(病毒感染对照组的噬斑数-实验组的噬斑数)/病毒感染对照组的噬斑数]×100%
再利用几率值分析法求得化合物的CC50和EC50值,测定结果见表3
3讨论
在合成金刚烷胺衍生物A1~A10的过程中,由2-氨基-3-巯基丙酸甲酯盐酸盐和金刚烷酰氯反应,预想得到的目标化合物是L-2-(1-金刚烷甲酰胺)-3-巯基丙酸甲酯,但通过对所得产物的氢谱、碳谱分析发现,其碳、氢含量明显偏高预测化合物的分子量应该是297,而实际质谱分析得到其分子量为460,故确定该化合物的结构为L-
2-(1-金刚烷甲酰胺)-3-(1金刚烷甲酰基)巯基丙酸甲酯(A10)之所以得到这个结果,推测是因为巯基也是较强的亲核基因,与金刚烷酰氯发生了反应抗禽流感病毒实验结果表明,大多数目标化
合物的抗禽流感病毒活性较弱,只有丙氨酸甲酯与金刚烷甲酰氯缩合物(A5)显示出较强的抗禽流感病毒活性(EC50=6.67mgL-1
),可作为先导化合物开展进一步研究在抗病毒实验筛选中,曾分别采用先加药后感染病毒加药同时感染病毒先感染病毒后加药3种方式进行实验,结果表明,新金刚烷胺衍生物在加药同时感染病毒的实验条件下显示一定的抗禽流感病毒活性,说明A5抗H5N1病毒作用是在病毒吸附阶段,其作用于病毒的表面而发挥抗病毒作用,而对细胞内的病毒没有抑制作用,也没有直接灭活病毒的作用
致谢:
武汉大学生命科学院田波院士在抗病毒筛选方面给予支持;武汉大学药学院实验中心邱国福教授在化合物结构测试和鉴定方面给予热情指导和帮助.
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