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白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究
本科学生毕业论文
论文题目:
白羽肉鸡多器官亚细胞结构研究
学院:
生命科学学院
年级:
2008级
专业:
生物工程
姓名:
吴俊生
学号:
20084568
指导教师:
李文辉
2012年5月3日
摘要
本研究以农业部“948”项目引进的法国罗斯308隐性白羽鸡为素材,运用TEM技术,测定了白羽肉鸡八个器官(心、肝、肺、皮、腿部肌肉、大肠、小肠、胃)细胞内细胞核、线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在胞内的分布情况。
研究白羽肉鸡机体内细胞核、线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在不同器官细胞内的分布情况,探讨其对机体用药和疫苗使用的细胞层次机制合理性具有重要的参考价值。
关键词
白羽肉鸡;组织包埋;切片染色;线粒体;细胞核;内质网;TEM技术
Abstract
Inthisstudy,"948"projectoftheMinistryofAgriculturetointroducetheFrenchRose308RecessiveWhitechickenmaterial,theuseofTEMtechniques,determinationofthewhitefeatherchickeneightorgans(heart,liver,lung,skin,legmuscle,largeintestine,smallintestine,stomach)withinthecellnucleus,mitochondria,endoplasmicreticulum,ribosomesandGolgiapparatusintheintracellulardistributionofThedistributionofthewhitefeatherchickenmachinebodyofthenucleus,mitochondria,endoplasmicreticulum,ribosomesandGolgiapparatusincellsofdifferentorganstoexplorethereasonablenessofitsbodymedicineandvaccinesusedinthecell-levelmechanismhasimportantreferencevalue.
Keywords
Whitefeatherchicken;Tissueembedding;Sectionstaining;Mitochondria;Ribosomes;Endoplasmicreticulum;TheTEMtechnology
目录
摘要I
AbstractII
1.前言1
1.1白羽肉鸡概述1
1.2白羽肉鸡疾病现状2
1.3禽类疾病与亚细胞结构2
1.4透射电子显微镜概述3
1.4.1透射电子显微镜成像原理3
1.4.2TEM制样技术4
2.材料与方法6
2.1实验材料6
2.2实验器材及试剂6
2.3实验方法6
3.结果与分析9
3.1透射电镜图9
3.2观察结果9
4.结论或讨论11
参考文献12
附录一13
附录二14
致谢15
1.前言
三十年来,我国经过大力发展白羽肉鸡产业,已成为世界三大肉鸡生产国之一。
但白羽肉鸡的疾病问题依然非常严重。
本研究以农业部“948”项目引进的法国罗斯308隐性白羽鸡为素材,运用TEM技术,测定了白羽肉鸡八个部位(心、肝、肺、皮、腿部肌肉、大肠、小肠、胃)细胞内线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在胞内的分布数量和大小。
实验活鸡取材,获取鸡的8种样本材料。
依次进行组织固定、脱水、包埋、切片等程序。
大多数药物通过作用于受体而发挥药理作用,而酶是药物作用的主要靶标(作用部位),通过抑制酶活性或激活酶活性而发挥药理作用,多数酶的本质是蛋白质,其中内质网、核糖体和高尔基体是蛋白质合成与运输过程中的重要细胞器。
线粒体除了作为细胞内能量生成的关键细胞器外,还与细胞凋亡、脂质代谢、自由基生成等重要生化过程密切相关。
近年来随着对线粒体结构和功能的深入研究,发现线粒体是多类药物的细胞内作用靶点,与相关药物之间存在广泛而复杂的相互作用[1],线粒体、内质网等细胞器在机体内的分布直接影响到有关药物的作用效果。
研究白羽肉鸡机体内细胞核、线粒体、内质网、核糖体及高尔基体在不同器官的分布情况对机体的合理使用药物和疫苗具有重要的参考价值。
1.1白羽肉鸡概述
白羽肉鸡属原鸡雉科有39对染色体,该品种由美国爱拔益加家禽育种公司育成,四系配套杂交,白羽。
此品种的特点是体型大,生长发育快,饲料转化率高,适应性强。
因其育成历史较长,肉用性能优良,为我国肉鸡生产的主要鸡种。
我国白羽肉鸡养殖产业,从上世纪八十年代开始,经过近30年的努力,已成为我国农业产业化发展最迅速、规模化最强,最典型的行业。
最近20年来,白羽肉鸡产量更是以年平均5%-6%的速度持续增长。
但是,中国作为一个养殖业高速发展的发展中国家,其家禽的饲养管理水平较低下,疾病防控能力更显不足;在白羽肉鸡流行性疾病的管控方面出现的问题非常突出。
据统计,我国因疾病损失占肉鸡总产量的20%[2]。
由此,生产成本的提高、出口的限制和公共卫生的安全都成了制约这一行业进一步发展的“短板”。
1.2白羽肉鸡疾病现状
我国幅员辽阔,生物多样,流动性居世界之首,其肉鸡疫病类别繁多。
又由于中国是历史悠久的农业古国,人类的发展与迁移历史造成养殖环境很复杂。
近三十年来,由于生物制品行业的快速壮大,疫苗厂家如雨后春笋、层出不穷;进而造成疫苗种类众多。
在免疫选择压力下,很多病毒迅速发生变异;又因不同品种鸡的免疫水平不一致,导致很多疫病在流行病学、临床症状及病理变化中呈现非典型化,如多次在世界范围爆发的禽流感。
常见的约10种细菌可使肉鸡发病,它们是:
大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、曲霉菌等。
细菌耐药性严重,多重耐用菌株多,药物残留问题都给养殖者造成很大困扰[3]。
另外,很多细菌病为人畜共患病,这就给食品安全和公共卫生带来严重隐患。
肉鸡生长速度快,代谢旺盛,需氧量大,极易发生呼吸道疾病。
致病微生物感染,不良气候条件,营养缺乏,有害气体中毒甚至免疫接种都可以引起呼吸道疾病发生,某些肉鸡群死淘率可达30%,损失严重。
常见病原体包括:
新城疫病毒、鸡毒支原体、大肠杆菌、传染性喉气管炎病毒等[4]。
它们存在明显的协同致病作用,特别是当鸡群中存在大肠杆菌和鸡毒支原体感染,接种新城疫和传染性法氏囊病时会出现比较严重的发病情况。
病毒性免疫抑制病普遍存在于肉鸡群中,常见的有传染性法氏囊病、传染性贫血病、马立克氏病和禽淋巴白血病等。
1.3禽类疾病与亚细胞结构
自进入21世纪后,禽流感在全球愈演愈烈,呈现世界性流行趋势。
据世界卫生组织(WHO)报道,截止2011年4月,全球人类感染H5N1亚型流感病毒的539个病例中已有318人死亡,病死率达到60%。
禽流感不仅给养禽业造成了巨大的损失,而且严重威胁到人类健康和安全。
1992年以来,H9N2亚型禽流感在国内时有流行和散发,已对中国的养禽业造成严重损失[5]。
在鸡群中免疫抑制作用会增加鸡体对病毒性和细菌性疾病的易感性[6],也有数据显示低致病性禽流感感染鸡群时出现的临床症状和严重程度与病毒毒株及共感染的免疫抑制类疾病密切相关[7-8]。
禽流感(AvianInfluenza,AI)是由A型流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度接触性急性传染病,已导致家禽及鸟类的普遍感染并对人类造成了严重的威胁[9]。
目前,在亚细胞水平的研究结果表明:
NS1蛋白(NonsreucturalProtein1,NS1)是A型流感病毒惟一的非结构蛋白,由第8个基因编码,可编码202个~237个氨基酸(AminoAcid,AA),在调节流感病毒的致病性及毒力方面发挥着重要的作用,它可能是H5N1亚型禽流感病毒高致死率的关键所在[10]。
在朱春玉等研究禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位中显示NS1蛋白在细胞核内呈聚集趋势[11]。
1.4透射电子显微镜概述
显微镜都是被人们用来观察人肉眼不能识别清楚的微小物体,将其放大成像的光学器材。
由于分辨能力的缘故,亚显微及超微结构必须应用电子显微镜才能达到清楚观察的目的。
1665年复合显微镜和1937年透射式电子显微镜诞生。
自1932年德国柏林大学E.Ruska等人制造的第一台实用电子显微镜,到高性能多功能电子显微镜的普遍使用,为亚细胞结构的研究开创了新阶段。
1953年瑞典人制造出优质的超薄切片机,和随后出现的各种电子染色方法,使超薄切片技术的得到成熟和完善;也迅速推动了电子显微镜技术在生物学领域中的广泛应用。
目前,生物电子显微镜技术已由细胞水平发展到分子水平和原子水平的结构测定上。
英国医学委员会分子生物学实验室的A.Klug博士将高分辨电子显微镜技术应用于生物大分子的结构测定上,由于他在核酸-蛋白质复合体的晶体结构研究方面作出的卓越贡献,荣获了1982年诺贝尔化学奖。
1.4.1透射电子显微镜成像原理
普通光学显微镜是用可见光作光源,照射到样品上,然后收集处理所得到的光信号,形成放大像。
电子显微镜则是用一束具有较高能量的电子,代替可见光照射到样品上,然后收集处理所得到的信号,形成放大像。
电子束在通过电磁场(电磁透镜)时发生曲折,与可见光在通过玻璃透镜时遵守同样的几何光学定律。
分辨率与所用光源的波长有密切关系。
电子束的波长远远小于可见光,所以它的分辨能力也就远远高于后者。
这就是所有电子显微镜(不论是透射的还是扫描的电子显微镜)与光学显微镜的主要区别。
现代透射电镜整体包括:
电子光学系统、真空系统、电气系统、水冷却循环系统和压缩空气系统等。
显微镜主体是电子光学系统,即镜筒。
考虑到机械稳定性,真空度易保性,电镜镜筒都制成直立式的,自下而上由一个个电磁透镜垒起来。
目前,比较主流的透射镜筒是6-8级成像透镜、电子枪室和观察室等组成,如本研究采用的日立-H7650。
阴极灯丝在加热电流作用下发射电子束,该电子束在阳极加速器下加速向下高速运动,途经第一、二聚光镜的会聚作用让电子束聚焦在样品表面,电子束透过样品后,再通过物镜、第一、二中间镜和投影镜,四级放大后成像于荧光屏上。
这四级放大透镜各级放大倍数的乘积就是电镜总的放大倍数,因此透射电镜有着更高的放大范围(2000x-1000000x)。
1.4.2TEM制样技术
在透射电镜生物样品的制备技术中,超薄切片技术是最关键的一环。
目前应用的冷冻切片技术,电镜细胞化学技术、以及电镜放射自显影技术等都是以超薄切片技术为基础的。
TEM在现代生物医学研究中起着越来越重要的作用,是研究超微结构的重要手段。
因生物医学研究种类的繁多和样品制作的特殊性,使得制作过程繁多而复杂,也对样品的取材、固定、脱水、包埋和切片等一系列程序提出了严格的要求[12]。
目前,本实验室透射电镜样品的制备的过程包括组织的固定和包埋、玻璃刀的制作、包埋块的修正、切片、半薄切片的染色、超薄切片的染色。
而TEM技术中提到的“超薄切片”,是指使用超薄切片机切割已经过树脂包埋过的样品,且保证厚度在0.1nm以下的切片。
切片的质量要确保薄而均匀,片子没有皱折、无钻石刀碎裂刀痕、震颤等缺陷。
尤其在制作过程的各个环节,要力求细胞微结构保存良好,无人为假象。
染色要深浅适宜,避免沉淀与污染且具有良好的反衬度。
1.组织的固定和包埋
生物样本在离开活体的正常环境之后,其组织结构在自溶酶作用下会迅速发生各种“死后”变化。
为了保持细胞结构的活体状态,组织必须从活体取得后,在最短时间内投入固定液,一般不超过1分钟。
本实验室采用戊二醛及锇酸双固定法。
固定的目的在于使离体组织尽量保持原有的形态结构。
组织包埋是电镜制样过程的重要环节。
2.玻璃刀的制作
切片刀的好坏是决定超薄切片质量的重要器材。
50年代开始使用玻璃刀,因其锋利,制作方便,且价格便宜,被普遍采用。
玻璃刀可用手工或制刀机制作。
3.包埋块的修正
聚合好的包埋块,在制片前,用刀片修成适当的大小和便于切片的金字塔形状,并使其中的组织块准确露出表面。
必须除去组织周围多余的包埋介质或无关的部分。
4.切片及切片的染色
生物样品的超薄切片,反差很弱,在电镜下无法看清细胞结构,必须进行提高反差的处理,这种提高反差的办法通称“电子染色”。
染色经常在置于铜网上的超薄切片上进行。
一般都是用重金属盐柠檬酸铅和醋酸双氧铀进行染色。
2.材料与方法
2.1实验材料
实验于4月12号在黑龙江大学农学楼605室,对3月龄白羽肉鸡活体取鲜活样本,包括心脏、肺、胃、大肠、小肠、皮肤、腿肌和肝脏。
2.2实验器材及试剂
手术刀、眼科剪、眼科镊、离心管、培养皿、解剖台、分析天平、精密酸度计、移液枪、容量瓶、双面刀片、载玻片、玻璃棒、烧杯、量筒、干燥箱、包埋模板、牙签、试剂瓶、切片机(LeicaEMUC6)、制刀机(LeicaEMKMR2)、透射电子显微镜(日立-H7650)、玻璃刀、带膜载网、钟表镊子、滤纸、胶头滴管、蜡纸、1%饿酸固定液、2.5%戊二醛、PH6.8磷酸缓冲液、蒸馏水、95%酒精、纯酒精、环氧丙烷、环氧树脂Epon812、MNA(甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐)、DDSA(十二烷基琥玻酸酐)和DMP-30(2,4,6-二甲氨基甲基苯酚)、天青Ⅱ、中性品红、醋酸铀、柠檬酸铅、硝酸铅、氢氧化钠。
2.3实验方法
1.先对活鸡进行清理除污,用医用酒精对手术刀、眼科镊等器具擦拭,之后活体宰杀。
2.白羽鸡的八个器官(心、肝、肺、皮、腿部肌肉、大肠、小肠、胃)进行组织鲜活取样。
3.即时将取下的组织放进装有PH6.8磷酸缓冲液的培养皿中。
4.及时从刚获取的八个组织块上分别取下1mm3小块,取材后快速放入预冷的磷酸缓冲液配制的2.5%戊二醛固定液(0—4℃)中固定2小时,后更换固定液。
继续固定样品72小时。
5.用PH6.8磷酸缓冲液漂洗样品,每次10min,共计3次;(这是避免戊二醛与锇酸发生氧化还原反应,生成沉淀。
)
6.1%饿酸固定液固定2—4h(0—4℃)。
7.用PH6.8磷酸缓冲液漂洗样品,每次10min,共计3次。
8.配制好包埋剂Epon812。
9.脱水:
固定的材料经缓冲液冲洗后,室温下进行脱水。
加入70%丙酮溶液,脱水15分钟;
将70%丙酮的溶液用一次性吸管吸出离心管,加入90%丙酮溶液,脱水15分钟;
将90%丙酮溶液用一次性吸管吸出离心管,加入100%丙酮溶液,脱水15分钟;
10.浸透:
在室温下或37℃条件下向样品的离心管中置入纯包埋剂,将所有离心管放入冰箱中4℃保存过夜。
11.包埋:
从冰箱中取出浸透过后的样品,用牙签把样品从离心管中挑出,置入包埋模具中并使之定位于合适的位置(依模具而定)。
12.向模孔注满Epon812包埋剂。
13.聚合:
把包埋好的模板放入温箱内聚合35℃,24h;45℃,24h;60℃,24h。
14.包埋块聚合后,分别用放入盒中装好编号,放于干燥器中保存备用。
15..在切片前,将包埋块用刀片修成梯形,使其中的组织块露出表面。
在制刀机上将玻璃条划割断块制成玻璃刀,用指甲油黏上胶带,制成供切片机使用的玻璃刀。
切片分为半薄切片(500—1000nm)和超薄切片(50—100nm),半薄切片供普通光学显微镜观察,超薄切片供透射电镜观察。
本实验采用600nm半薄切片和60nm超薄切片。
16.打开切片机电源,固定好修好的包埋块,设置参数,半薄设置成600nm、超薄设置成60nm。
17.将玻璃刀固定在切片机上,并往玻璃刀注入蒸馏水。
18.修好的八个包埋块依次进行切片,以获得切片带,从中捞取得到理想无褶皱的切片。
19.半薄切片:
将捞起的切片放进滴有蒸馏水的载玻片上,并贴上标签。
超薄切片:
用镊子夹住带膜铜网浸入水下,并迅速移动载网与水面切片接触后向上捞起,用滤纸吸去载网上多余的水分,放于带滤纸的培养皿中,记下编号。
20.半薄切片需要将载玻片放进干燥箱中烘烤20~30min,超薄不需要烘烤。
21.半薄切片烘烤完后,需要脱脂染色。
超薄直接染色透射电镜下观察。
22.半薄切片染色:
先用天青Ⅱ染1-2min后用水洗2-3次,再用中性品红染1-2min,水洗2-3次。
用滤纸吸干多余水分,光学显微镜下观察。
23.超薄切片染色:
将饱和醋酸铀水溶液用滴管滴加到事先放于培养皿中的蜡纸上。
将带切片的铜网有切片的一面用镊子夹放到染色液表面染色30min-2h(避光)。
染色后铜网迅速用蒸馏水漂洗几次,用滤纸吸干。
另一培养皿放一蜡纸,四周滴上1mol/LNaOH(用以吸收容器中CO2)。
用另一清洁滴管吸柠檬酸铅染液滴于蜡纸上,铜网放于染液表面3-5min。
铜网用蒸馏水漂洗数次,滤纸去掉多余水分,保存于干燥器中,待透射电镜下观察。
24.透射电镜下观察切片,本实验采用80.0kv电压,放大倍数分别有10000x、15000x和20000x。
3.结果与分析
本研究对白羽肉鸡八个样品(心、肝、肺、皮、腿部肌肉、大肠、小肠和胃)切片观察,得到了各个样品的透射电镜图,部分图示及分析结果如下。
3.1透射电镜图
图3-1心肌(20000x)图3-2肺(10000x)
图3-3肝(20000x)图3-4骨骼肌(20000x)
3.2观察结果
研究发现心肌细胞间的隔膜突出,心肌纤维均匀紧密,肌原纤维之间有密集的线粒体,整个线粒体的分布密度很大,心肌纤维中间有细胞核,在核的周围和肌原纤维之间有少量的内质网和糖原颗粒。
肝透射图中细胞膜、细胞胞浆和细胞核清晰可见,线粒体基质很密,胞浆基质内糖原颗粒比较丰富,粗面内质网和光面内质网分布数量不等。
肺组织电镜图显示,细胞核清晰可见,线粒体分布较多,并有大量的空洞(肺泡)。
皮组织中细胞密集分布,电镜下可看到大量的细胞核,有少量线粒体分布。
骨骼肌图片显示很多线粒体围绕在肌原纤维周边,其他细胞器很少见。
胃、大肠和小肠中细胞核、线粒体都比较多,尤其是内质网、高尔基体、核糖体大量分布于细胞质中。
4.结论或讨论
根据以上观察的结果及分析,可以获得结论。
线粒体在心肌和骨骼肌中有大量分布,细胞核在表皮组织中的分布要明显多于其他组织器官,内质网、高尔基体、核糖体主要分布在胃、大肠、小肠中、肝和肺中线粒体等四种细胞器平均水平都要多于其他组织器官中的。
根据不同药物的作用方式选择药物的注射部位和剂量,通过较为准确的接近定位于不同亚细胞结构的酶的活性中心面,来抑制或提高细胞某些蛋白的合成方式来达到药效。
可以选择注射胃、大肠、小肠等内质网和高尔基体细胞器较丰富或离这些部位较近的组织器官。
同理,通过作用于细胞线粒体的能量转化等方式来达到药效的药物可以选择对心肌和骨骼肌等线粒体丰富的部位用药。
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附录一
一、戊二醛-饿酸双固定液的配方:
A.胂酸钠缓冲液(或0.1mol/L磷酸缓冲液)
a.0.1mol/L二甲基胂酸钠
b.0.1mol/LHCl
a液100ml+b液5.4ml用水稀释至200ml,pH7.2~7.4。
B.3%戊二醛固定液
0.05mol/L胂酸缓冲液88ml
25%戊二醛12ml
pH7.2~7.4
C.2%饿酸原液
D.1%饿酸(caulqield)固定液。
0.05mol/L胂酸钠缓冲液2ml
0.1mol/LHCl8ml
2%饿酸4ml
重蒸水4ml
蔗糖0.015g/ml
二
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- 肉鸡 器官 细胞 结构 研究