反式白藜芦醇对Aβ2535诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用学位论文.docx
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反式白藜芦醇对Aβ2535诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用学位论文.docx
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反式白藜芦醇对Aβ2535诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用学位论文
分类号:
R74
学号:
2010282
学校代码:
密级:
公开
硕士学位论文
(专业型学位)
反式白藜芦醇对Aβ25-35诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用
Protectiveeffectoftrans-resveratrolonhippocampalneuronsofratswithAβ25-35-inducedAlzheimer’sdisease
姓名:
专业:
神经病学
研究方向:
神经系统变性疾病
导师:
培养单位:
**医学院
2013年5月
**医学院硕士研究生
学位论文独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。
其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。
学位论文作者签名:
签字日期:
年月日
**医学院学位论文版权使用授权书
本人完全了解**医学院有关保留、使用学位论文的规定,即:
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保密的学位论文在解密后适用本授权书。
学位论文作者签名:
导师签名:
签字日期:
年月日签字日期:
年月日
英文缩列表
缩略词
英文全称
中文全称
real-timeRT-PCR
realtimereversetranscriptionpolymerasechainreaction
逆转录实时定量聚合酶链反应
Caspase
cysteine-containingspartate-specificproteases
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶
Aβ25-35
Amyloidβ-ProteinFragment25-35
β淀粉样蛋白25-35片段
AD
AlzheimerDisease
阿尔茨海默病
PBS
phosphatebufferedsaline
磷酸盐缓冲液
MWM
Morriswatermaze
Morris水迷宫
NFT
neurofibrillarytangles
神经元纤维缠结
SP
senileplaques
老年斑
TEMED
tetramethylethylenediamine
四甲基乙二胺
AP
ammonniumpersulfate
过硫酸铵
H.E
Henatoxylinandeosin
苏木紫-伊红
TBS
tris-buffersolution
三羟甲基氨基甲烷缓冲液
目录
1、论文:
反式白藜芦醇对Aβ25-35诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用
英汉缩略词对照表……………………………………………………2
中文摘要………………………………………………………………4
英文摘要………………………………………………………………6
前言……………………………………………………………………8
材料与方法……………………………………………………………10
结果……………………………………………………………………20
讨论……………………………………………………………………30
结论……………………………………………………………………33
参考文献………………………………………………………………34
2、综述:
阿尔茨海默病的发病机制及治疗的研究进展………………38
3、致谢……………………………………………………………………48
4、作者简介………………………………………………………………50
反式白藜芦醇对Aβ25-35诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用
目的:
观察反式白藜芦醇(Trans-Resveratrol,TR)对Aβ25-35诱导阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用,并探讨其可能作用机制。
方法:
雄性SD大鼠大鼠随机分为假手术组、阳性对照组(多奈哌齐)、模型组(Aβ25-35)、TR低剂量组、TR高剂量组,给予Aβ25-35海马注射,造模结束后灌胃,每日一次,连续15天。
阳性对照组给予多奈哌齐(安理申)1mg/kg,治疗组给予TR低剂量TR10mg/kg,高剂量给予TR40mg/kg。
第11天开始行Morris水迷宫检测,第15天处死大鼠取材,HE染色观察海马神经元损伤情况,采用realPCR检测caspase12mRNA表达,采用WesternBlot和免疫组化方法,检测caspase8和caspase12蛋白表达。
结果:
大鼠海马注射Aβ25-35后,假手术组、阳性对照组(多奈哌齐)、模型组(Aβ25-35)、TR低剂量组、TR高剂量组水迷宫检测在定向航行实验中第一天的逃避潜伏期分别是59.0±18.2,65.2±27.8,98.8±19.9,77.7±20.4,66.6±25.9;第二天的逃避潜伏期分别是25.0±14.5,32.4±21.2,72.8±25.0,52.4±14.8,33.3±15.1;第三天逃避的潜伏期分别是20.3±12.0,25.1±12.9,67.2±17.8,44.8±23.2,26.2±19.7;第四天的逃避潜伏期是10.3±4.8,12.0±5.8,62.6±22.1,30.3±11.5,14.2±4.7;在空间搜索实验中第五天的校正潜伏期分别是32.8±8.4,25.3±5.5,15.6±1.2,21.7±4.8,28.0±4.9。
假手术组、阳性对照组(多奈哌齐)、模型组(Aβ25-35)、TR低剂量组、TR高剂量组PCR法检测caspase12mRNA的表达量分别为55.70±10.12,91.11±7.06,181.49±38.68,138.43.26±15.28,98.06±23.05;westernblot法检测caspase8蛋白的表达量分别为0.18±0.03,0.29±0.02,0.64±0.04,0.57±0.05,0.31±0.03;westernblot法检测caspase12蛋白的表达量分别为0.19±0.05,0.29±0.03,0.68±0.03,0.60±0.05,0.32±0.04。
大鼠注射Aβ25-35后,与假手术组相比,模型组逃避潜伏期明显延长在定向航行实验验中(P<0.01),校正潜伏期明显缩短在空间搜索试验中(P<0.01),海马神经元明显受损,Caspase12mRNA和caspase8蛋白表达明显增加(P<0.01)。
和模型组比较,TR治疗组在定向航行实验中逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),在空间搜索实验中校正潜伏期明显延长(P<0.05),HE染色TR明显减轻了海马神经元损伤,TR显著降低了大鼠海马caspase12mRNA的表达(P<0.05),同时降低了caspase8和caspase12蛋白表达(P<0.05)。
结论:
TR对Aβ25-35致AD大鼠海马神经元有保护作用,其机制可能部分是因为抑制caspase12mRNA表达、caspase8和caspase12蛋白表达有关。
关键词:
反式白藜芦醇;海马;学习;记忆;caspase8;caspase12;
Protectiveeffectoftrans-resveratrolonhippocampalneuronsof
ratswithAβ25-35-inducedAlzheimer’sdisease
Objective:
Toinvestigatetheprotectiveeffectoftrans-resveratrolonhippocampalneuronsofratswithAβ25-35-inducedAlzheimer’sdisease,andexploreitspossiblemechanisms.
Methods:
Ratsarerandomlydividedintoshamgroup,positivecontrolgroup(donepezil),modelgroup(Aβ25-35),low-andhigh–doseofTRgroups,respectively(n=9).AfterinjectionofAβ25-35intohippocampus,ratswereadministratedwith1.0mg·kg-1donepeziland10and40mg·kg-1TRoncedailybygavageforconsecutive15daysrespectively,whileshamandmodelgroupswereadministratedwithvolume-matchednormalsalinebygavage.ThelearningandmemoryabilityofratsweredetectedbyMorriswatermazetest.neuronalinjuryinhippocampuswasobservedbyhematoty-eosinstaining,andthemRNAexpressionlevelsofcaspase12weredetectedbyrealtimePCRandtheproteinexpressionsofcaspase8andcaspase12wereexaminedbyimmunohistochemistryandWesternblotintherathippocampus.
Results:
IntheratshippocampusafterinjectionofAβ25-35,theescapelatencies(s)ofshamgroup,positivecontrolgroup(donepezil),modelgroup(Aβ25-35),low-andhigh–doseofTRgroupsonthefirstdayinthenavigationtestbyMorriswatermazetestwere59.0±18.2,65.2±27.8,98.8±19.9,77.7±20.4,66.6±25.9respectively;theescapelatencies(s)ontheseconddaywere25.0±14.5,32.4±21.2,72.8±25.0,52.4±14.8,33.3±15.1respectively;theescapelatencies(s)onthethirddaywere20.3±12.0,25.1±12.9,67.2±17.8,44.8±23.2,26.2±19.7respectively;theescapelatencies(s)onthefourthdaywere10.3±4.8,12.0±5.8,62.6±22.1,30.3±11.5,14.2±4.7;Theadjustedescapelatenciesonthefifthdayinspatialprobetestwere32.8±8.4,25.3±5.5,15.6±1.2,21.7±4.8,28.0±4.9respectively.ThemRNAexpressionsofcaspase12ofshamgroup,positivecontrolgroup(donepezil),modelgroup(Aβ25-35),low-andhigh–doseofTRgroupsbyrealtimePCRwere55.70±10.12,91.11±7.06,181.49±38.68,138.43.26±15.28,98.06±23.05respectively;Theproteinexpressionsofcaspase8bywesternblotwere0.18±0.03,0.29±0.02,0.64±0.04,0.57±0.05,0.31±0.03respectively;Theproteinexpressionsofcaspase12byWesternblotwere0.19±0.05,0.29±0.03,0.68±0.03,0.60±0.05,0.32±0.04respectively.Comparedtothesham-treatedrats,Aβ25-35injectionsignificantlyprolongedthemeanescapelatencyinthenavigationtestandshortenedtheadjustedescapelatencyinspatialprobetest(P<0.01),NeurnalinjuryinhippocampusandthemRNAexpressionofcaspase12,aswellastheproteinexpressionsofcaspase8andcaspase12inrathippocampuswereincreased(P<0.01).Comparedwiththemodelrats,Trans-resveratrol–treatedgroupssignificantlyshortenedthemeanescapelatencyinthenavigationtestandprolongedtheadjustedescapelatencyinspatialprobetest(P<0.05),andattenuatedneuronalinjuryinrathippocampus,andsignificantlydecreasedthemRNAexpressionsofCaspase12,aswellastheproteinexpressionsfcaspase8andCaspase12inrathippocampus(P<0.05).
Conclusion:
Thereisprotectiveeffectoftrans-resveratrolonhippocampalneuronsofratswithAβ25-35-inducedAlzheimer’sdisease,itsmechanismsmaybeatleastpartlyduetodecreasingthemRNAandproteinsexpressionofcaspase8andcaspase12inrathippocampus.
KeyWords:
trans-resveratrol;hippocampus;learning;memory;caspase8;caspase12;
前言
阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)又称老年性痴呆,是常见的神经系统变性疾病在老年人中。
主要病理基础是大脑萎缩,主要病理特点是老年斑(senileplaque,SP)形成,神经纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)和广泛的海马神经元缺失等。
AD病情隐匿,进行性智力减退,多伴有性格改变,以近记忆损害为主,严重影响患者的生活质量。
临床上可将阿尔茨海默病根据临床特征分成3个阶段。
初期阶段一般表现为短暂记忆缺失,近记忆比远记忆损害严重。
在中期阶段,患者认知和语言功能明显下降,可出现视听幻觉。
最后阶段出现运动障碍和认知功能严重下降,出现幻觉和幻想。
我们应该及早发现该病,尽早治疗。
目前AD还没有有效的治疗方法,目前临床上常用的有多奈哌齐、他克林、石杉碱甲(哈伯因)等,只能缓解病人的症状,而且副作用大,中药治疗是目前的新靶点,而且我国有丰富的中草药资源,利用中草药多靶点的作用在我国对AD预防和治疗取得了一些效果,值得进一步深入研究。
有关AD的研究,目前国内外均处在前期研究阶段。
目前AD的发病机制不清,目前主要有Aβ毒性机制、Tau蛋白学说机制、基因突变机制、钙平衡失调机制等,本研究采用Aβ25-35诱导AD模型,研究表明,过量的淀粉样蛋白毒性作用和对神经元损伤在AD中起主要作用[1],各种原因诱发AD的共同通路是脑内Aβ沉积[2],因此Aβ25-35诱导AD模型较为理想的模型,同时有研究表明AD患者脑内有大量神经元凋亡,caspase家族凋亡因子表达增高显著[3]。
Caspase8是Caspase家族中主要成员之一,起着关键作用在细胞凋亡中。
caspase12是内质网应激的特异性凋亡蛋白,内质网应激凋亡通路是一种凋亡通路的新途径,所以caspase12很可能在AD的发病中扮演了重要角色。
近年越来越多的研究关于阿尔茨海默氏病的中医药治疗,白藜芦醇的神经保护作用,已经成为的科学家的热点问题在神经病学研究范围内[4]。
白藜芦醇(resveratrol),化学名称是3,5,4-羟基苯二烯,分子式为C14H12O3,主要存在于葡萄、虎杖等植物中,属于多酚类化合物[5],不易溶于水,易溶解在甲醇等有机化合物中。
白藜芦醇可以分为顺式白藜芦醇和反式白藜芦(trans-resveratrolTR),TR活性比顺式白藜芦醇作用强。
白藜芦醇具有抗氧化、清除氧自由基、神经保护等作用[6,7,8],但具体作用机制尚不明确。
研究表明白藜芦醇对于治疗AD疗效显著[9]。
既往研究TR对Aβ25-35诱导AD大鼠有保护作用,其机理可能部分与抑制iNOS、caspase8、caspase9mRNA表达有关[10,11]。
目前关于TR对AD的保护作用研究,通过内质网应激凋亡通路caspase12表达的影响,国内外研究较少。
本实验以相关文献报道的白藜芦醇抗AD作用为依据,通过观察TR对海马神经元细胞形态影响,探讨TR对AD的保护作用及潜在的机制。
进一步证实了TR的神经保护作用对AD大鼠海马神经元,可能与抑制caspase12mRNA,caspase12和caspase8蛋白表达有关,为TR临床应用打下基础,同时提供TR治疗AD的药理学依据及可能的发病机制。
1材料
1.1主要实验材料
实验动物SD大鼠,第三军医大学大坪医院医学实验动物中心野战外科研究所提供,SPF级,每只大鼠体重大约250-280g,[许可证号:
SCXK(渝)2007-0005]
1.2主要实验试剂
反式白藜芦醇(TR)(粉剂,纯度为98%)
盐酸多奈哌齐(安理申)
Aβ25-35
逆转录试剂盒
β-actin
陕西慈缘生物技术有限公司
卫材药业(中国)有限公司
Sigma公司
大连宝生物工程有限公司
大连宝生物工程有限公司
Caspase12引物
SABC免疫组化试剂盒
DAB显色试剂盒
Caspase8多克隆抗体
caspase12多克隆抗体
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)
HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)
大连宝生物工程有限公司
武汉博士德生物工程有限公司
武汉博士德生物工程有限公司
北京博奥森生物技术有限公司
北京博奥森生物技术有限公司
碧云天生物技术研究所
碧云天生物技术研究所
RIPA裂解液
碧云天生物技术研究所
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒
碧云天生物技术研究所
PVDF膜(进口分装)
碧云天生物技术研究所
BCA蛋白浓度测定试剂盒
碧云天生物技术研究所
彩色预染蛋白质分子量标准
碧云天生物技术研究所
BeyoECLPlus
碧云天生物技术研究所
Western一抗稀释液
碧云天生物技术研究所
Western二抗稀释液
碧云天生物技术研究所
1.3主要仪器
MT-200Morris水迷宫
脑立体定位仪
成都泰盟科技有限公司
深圳瑞沃德生命科技有限公司
LD4-2离心机
北京医用离心机厂
BeckManCoulter冷冻离心机
美国贝克曼公司
实时荧光定量PCR仪
美国BIO-RAD公司
逆转录仪
德国Eppendorf公司
DDY-10型三恒电泳仪
美国BIO-RAD公司
DDY-7BⅢ型转移电泳仪
美国BIO-RAD公司
Model550型酶标仪
美国BIO-Tek公司
Centrifuge5415D离心机
德国Eppendorf公司
全自动凝胶图象分析仪
美国BIO-RAD公司
TU1810紫外分光光度计
北京普析仪器有限责任公司
MilliQA纯水处理器
Millipore公司
-80℃低温冰箱
德国FormaScientic公司
石蜡切片机
德国Leica公司
显微镜
德国Leica公司
2实验方法
2.1Aβ25-35制备
Aβ25-35用0.9%氯化钠注射液稀释为1μg/μL溶液,37℃孵育7天,成为聚集态,这样可以使Aβ25-35毒性增加,放在4℃待用。
2.2动物分组和给药
雄性SD大鼠45只,随机分五组,假手术组,阳性对照组(多奈哌齐),模型组(Aβ25-35),TR低剂量组,TR高剂量组,每个组9只大鼠。
制模完毕后给大鼠灌药,每天一次灌胃,连续灌药15d。
阳性对照组给予多奈哌齐(安理申)1mg·kg-1,低剂量组给予TR10mg·kg-1,高剂量组TR40mg·kg-1,假手术组和模型组给予同体积的生理盐水。
2.3动物模型制备
用10%水合氯醛麻醉,每100g体重0.35mL水合氯醛麻醉,在腹腔注射,麻醉后在脑立体定位仪上把大鼠固定,按照脑立体定位图谱,其操作按be既往方法进行[10],大鼠头顶部的毛除去,消毒正中的切口,切口为矢状位,把骨膜剥离好,然后剥除,确定好前后囟的位置,而且使之处在同一个水面上取前囟左右侧各2.5mm,后5.0mm,从头顶颅骨表面进针3.5mm深处,用微量注射器在大鼠双侧海马区注入Aβ25-35,,侧各组明,醇藜芦醇,反式白藜芦醇活性比顺式白藜芦醇作用强。
目前每侧5μL(5μg),假手术组注入等体积生理盐水,每测注射完毕后留针5分钟,缝合,术后预防切口感染用青霉素注射。
2.4水迷宫行为学分析
记录系统、安全岛和圆形水池组成水迷宫,用来检测大鼠学习记忆能力,水池高为38cm,直径为120cm,水深为30cm,水温约25℃,使池水浑浊用奶粉。
水池分为四个大小相等的象限,安全岛放于(平台)任何一个象限中点均可。
安全
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- 反式 藜芦 2535 诱导 阿尔茨海默病 大鼠 海马 神经元 保护 作用 学位 论文