水溶性维生素的测定.docx
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水溶性维生素的测定
第三节水溶性维生素的测定
水溶性维生素B1、B2和C,广泛存在于动植物组织中,饮食来源充足,但由于它们本身的水溶性质,除满足人体生理、生化需求外,任何多余量都会从机体中排出。
为避免缺乏,需要经常由饮食来提供。
水溶性维生素都易溶于水,而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。
在酸性介质中很稳定,既使加热也不破坏;但在碱性介质中不稳定,易于分解,特别在碱性条件下加热,可大部分或全部被破坏。
它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响;维生素B2对光,特别是紫外线敏感,易被光线破坏;维生素C对氧、铜离子敏感,易被氧化。
由于水溶性维生素具有上述特性,测定水溶性维生素时,一般都在酸性溶液中进行前处理。
维生素B1、B2通常采用盐酸水解,或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用,使结合态维生素游离出来,还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。
测定水溶性维生素常用高效液相色谱法、荧光法、比色法和微生物法等。
一、维生素B1的测定(荧光法,GB/T5009.84—2003)
维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素,通常以游离态,或以焦磷酸酯形式存在于自然界。
在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。
动物组织不如植物含量丰富。
维生素B1在水中溶解度较大,在酸性溶液中较稳定,在碱性溶液中加热极易分解。
近年来对利用带荧光检测器的高效液相色谱测定法进行了许多研究,并应用于实际试样测定。
这里我们主要介绍荧光法(参考GB/T5009.84-2003食品中硫胺素(维生素B1)的测定)
(一)荧光法
1.原理
试样在酸性溶液中加热,提取维生素B1,经蛋白分解酶处理,使维生素B1成为游离型。
再经层析柱纯化,去除荧光淬灭物质,同时浓缩,用碱性铁氰化钾溶液将其氧化成硫色素,在紫外线下,硫色素发出荧光,再给定的条件下以及没有其他物质干扰时,此荧光之强度与硫色素量成正比即与溶液中维生素B1量成正比。
如试样中含杂质过多,应经过离子交换剂处理,使硫胺素与杂志分离,然后以所得溶液做测定。
2.试剂
⑴盐酸(0.1mol/L):
8.5mL浓盐酸(相对密度1.19或1.20)用水稀释至1000mL;
⑵盐酸(0.3mol/L):
25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL;
⑶乙酸溶液:
30mL冰乙酸用水稀释至1000mL;
⑷氢氧化钠溶液(150g/L):
15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL;
⑸无水硫酸钠;
⑹乙酸钠溶液(2mol/L):
164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL;
⑺氯化钾溶液(250g/L):
250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL;
⑻酸性氯化钾溶液(250g/L):
8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL;
⑼1%铁氰化钾溶液(10g/L):
1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL。
放于棕色瓶内保存;
⑽碱性铁氰化钾溶液:
取4mL10g/L铁氰化钾溶液,用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。
用时现配,避光使用;
⑾正丁醇:
需经重蒸馏后使用;
⑿淀粉酶和蛋白酶;
⒀活性人造浮石:
称取200g40目~60目的人造浮石,以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次,每次10min;再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min;然后再用稀乙酸溶液搅洗10min;最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。
于蒸馏水中保存;
⒁硫胺素标准贮备液(0.1mg/mL):
准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素,溶于0.01mol/L盐酸中,并稀释至1000mL。
于冰箱中避光保存;
⒂硫胺素标准中间液(10μg/mL):
将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。
此溶液每毫升相当10μg硫胺素。
于冰箱中避光可保存数月;
⒃硫胺素标准使用液(0.1mg/mL):
将硫胺素标准中间液用水稀释100倍,用时现配;
⒄溴甲酚绿溶液(0.4g/L):
称取0.1g溴甲酚绿,置于小研钵中,加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻,再加入少许水继续研磨至完全溶解,用水稀释至250mL。
3.仪器
⑴电热恒温培养箱;
⑵荧光分光光度计;
⑶Maizel-Gerson反应瓶;
⑷盐基交换管。
4.操作步骤
⑴试样制备
试样准备
样品采集后用匀浆机打成匀浆保存于低温冰箱中冷冻,用时将其解冻后使用。
干燥试样要将其尽量粉碎后备用。
提取
准确称取适量试样(估计其硫胺素含量约为10μg~30μg,,一般称取2g~10g试样)置于100mL三角瓶中,加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解,放入高压锅中加热水解,121℃30min,凉后取出。
用2mol/L乙酸钠调pH值为4.5(以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂)。
按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。
于45℃~50℃温箱过夜保温(约16h)。
凉至室温,定容至100mL,然后混匀过滤,即为提取液。
净化
用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部,加水将棉纤维中气泡排出,再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。
保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。
用移液管加入提取液20mL~60mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2μg~5μg)。
加入约10mL热蒸馏水冲洗交换柱,弃去洗液。
如此重复三次。
加入20mL250g/L酸性氯化钾(温度为90℃左右),收集此液于25mL刻度试管内。
冷至室温,用250g/L酸性氯化钾定容至25mL,即为试样净化液。
重复上述操作,将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液,即得到标准净化液。
氧化
将5mL试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。
在避光条件下将3mL150g/L氢氧化钠加入反应瓶A,将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B,振摇约15s,然后加入10mL正丁醇;将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。
重复上述操作,用标准净化液将代替试样净化液。
静置分层后吸去下层碱性溶液,加入2g~3g无水硫酸钠使溶液脱水。
⑵测定
荧光测定条件:
激发波长365nm;发射波长435nm;激发波狭缝5nm;发射波狭缝5nm。
依次测定下列荧光强度:
a. 试样空白荧光强度(试样反应瓶A);
b. 标准空白荧光强度(标准反应瓶A);
c. 试样荧光强度(试样反应瓶B);
d. 标准荧光强度(标准反应瓶B)。
5.结果计算
式中X—样品中硫胺素含量,mg/100g;
U—样品荧光强度;
Ub—样品空白荧光强度;
S—标准荧光强度;
Sb—标准空白荧光强度;
c—硫胺素标准使用液浓度,μg/mL;
V—用于净化的硫胺素标准使用液体积,mL;
V1—样品水解后定容之体积,mL;
V2—样品用于净化的提取液体积,mL;
m—样品质量,g;
100/1000—样品含量由μg/g换算成mg/100g的系数。
6.说明及注意事项
⑴一般食品中的维生素B1游离型的,也有结合型的,即与淀粉、蛋白质等结合在一起的,故需用酸或酶水解,是结合型维生素B1成为游离型,再采用此法测定。
一般淀粉酶含有维生素B1要用白土吸附去除,但需要迅速处理,否则酶活性降低。
⑵谷物类物质不需酶分解,样品粉碎后用250g/L酸性氯化钾直接提取。
⑶样品与铁氰化钾溶液混合后,所呈现的黄色应至少保持15s,否则应再滴加铁氰化钾溶液1~2滴,因样品中含有还原性物质,而铁氰化钾用量不够时,硫胺素氧化不完全,但过多的铁氰化钾又会破坏硫胺素,其用量应恰当。
⑷紫外线破坏硫胺素,因此硫胺素形成后要迅速测定并力求避光操作。
⑸加热酸性KCL时不能使其沸腾,热KCL滤速较快,而不沸则是使其不至因过饱和而在洗涤中结晶析出阻塞交换柱。
⑹氧化中加铁氰化钾是整个实验的关键,对每个样品所加试剂的次序、快慢、振摇时间等都必须尽量一致,尤其是用正丁醇提取硫色素时必须保证准确振摇90s。
(二)高效液相色谱法(HPLC)
1.原理
维生素B1测定通常采用反相键结合相色谱法进行分离,利用紫外检测器或荧光检测器检测。
利用荧光检测器检测时,应首先使从样品中提取出来的维生素B1氧化成硫色素,然后转入正丁醇或异丁醇中,再进行HPLC分析。
HPLC法快速、简便、准确、灵敏度高。
2.试剂
⑴0.0025mol/L磷酸盐缓冲溶液(PH7.4);
⑵流动相:
以磷酸盐缓冲液80份和乙腈20份相互混合而成;
⑶碱性氰化钾溶液:
吸收97mL150g/LNaOH溶液加入3mL10g/L铁氰化钾相互混合而成;
⑷维生素B1标准溶液:
用0.01mol/L盐酸溶液将符合药典的盐酸硫胺素配制成100μg/mL维生素B1标准溶液;
⑸维生素B1标准使用溶液:
取维生素B1标准溶液2mL,用重蒸馏水定容至100mL,最终浓度为2μg/mL;
⑹混合酶溶液:
根据酶的活度和活力,用2mol/LCH3COONa溶液取适量的淀粉酶和木瓜蛋白酶配制成各3%的浓度。
3.仪器
⑴液相色谱仪(配荧光分光检测器和记录仪);
⑵微量注射器(5、10μL微量注射器);
⑶实验室常用设备。
4.操作步骤
⑴样品处理
将固体样品粉碎后过20目筛备用。
肉类及水产品样品经捣碎机捣碎。
果蔬类样品也经捣碎后备用。
称取样品1.00g(维生素B1含量不低于0.5μg)于50mL棕色容量瓶中,加入35mL0.1mol/L盐酸溶液,在超声波浴中处理3min或转动摇动,在高压灭菌器内于121℃、20~30min或者置于沸水中加热30min,然后轻摇数次。
取出,冷却至40℃以下,分别加入2.5mL混合酶液,摇匀,置于37℃下过夜或于42~43℃加热4h,冷却,用水定容至50mL,样液经3000r/min的速度离心后过滤,取约10mL滤液备用。
取上述滤液5mL于60mL分液漏斗中,边振边沿分液漏斗壁加入3mL碱性铁氰化钾溶液,继续振摇10s,立即加入8mL异丁醇,并猛烈振摇45s,静置分层后,弃去水层。
有机相通过无水硫酸钠小柱,收集待测溶液维生素B1。
维生素B1标准使用溶液:
分别取0.00、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00mL维生素B1于50mL的棕色容量瓶中,再加入与样品等量的0.1mol/L盐酸溶液,以下操作方法与样品处理相同。
⑵样品测定
样品液与维生素B1分别进样分析(等量进样)。
色谱分析条件
色谱柱为YWG–C18,250mm×3.8mm(内径,简写为i.d.);
激发波长为435nm;
狭缝为10nm;
发射波长为375nm;
狭缝为12.5nm;
灵敏度为10;
流动相速度为1mL/min;
进样量为4μL或8μL。
5.结果结算
以标准系列的峰高为纵坐标,标准系列的维生素B1含量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。
计算公式为:
式中X—维生素B1含量,μg/g;
m1—由标准曲线查得相当于维生素B1的质量,μg;
m—进入色谱内的样品质量,g。
二、食品中核黄素的测定(GB/T5009.85—2003)
维生素B2即核黄素,在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。
核黄素是机体许多重要辅酶的组成成分,对机体内糖、蛋白质、脂肪代谢起着重要作用。
缺乏时会发生口角炎、舌炎等。
膳食中的主要来源是各种动物性食品,其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多,其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。
人体不能合成。
核黄素为橙黄色针状结晶化合物,由于具有橙黄色,又称核黄素。
味苦,易溶于水和乙醇,水溶液呈黄绿色荧光。
维生素B2在酸性溶液中稳定、耐热。
在碱性溶液中极易受光照射而被破坏。
游离核黄素对光、紫外线敏感。
维生素B2是由异咯嗪基和核糖醇基所组成的
核糖醇基
异咯嗪基
维生素B2的化学式
(一)荧光法
1.原理
核黄素在440nm~500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。
在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。
在波长525nm下测定其荧光强度。
试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4),将核黄素还原为无荧光的物质,然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度,两者之差即为样品中核黄素所产生的荧光强度。
2.试剂
试验用水为蒸馏水。
试剂不加说明为分析纯。
⑴盐酸(0.1mol/L);
⑵氢氧化钠(1mol/L);
⑶氢氧化钠(0.1mol/L);
⑷硅镁吸附剂:
60目~100目;
⑸无水乙酸钠溶液(2.5mol/L);
⑹低亚硫酸钠溶液(200g/L):
此液用时现配。
保存在冰水浴中,4h内有效;
⑺洗脱液:
丙酮+冰乙酸+水(5+2+9);
⑻溴甲酚绿指示剂:
(0.4g/L);
⑼高锰酸钾溶液(30g/L);
⑽过氧化氢溶液(3%);
⑾木瓜蛋白酶(10%):
用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。
使用时现配制;
⑿淀粉酶(10%):
用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。
使用时现配制;
⒀核黄素标准溶液的配制(纯度98%);
核黄素标准储备液(25μg/L):
将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。
经过24h后,准确称取50mg,置于2L容量瓶中,加入2.4mL冰醋酸和1.5L水。
将容量瓶置于温水中摇动,待其溶解,冷至室温,稀释至2L,移至棕色瓶内,加少许甲苯盖于溶液表面,于冰箱中保存。
核黄素标准使用液:
吸取2.00mL核黄素标准储备液,置于50mL棕色容量瓶中,用水稀释至刻度。
避光,贮于4℃冰箱,可保存一周。
此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。
3.仪器
⑴实验室常用设备;
⑵高压消毒锅;
⑶电热恒温培养箱;
⑷核黄素吸附柱;(图片)
⑸荧光分光光度计。
4.分析步骤
整个操作过程需避光进行。
⑴试样提取
试样的水解
准确称取2g~10g样品(约含10μg~200μg核黄素)于100mL三角瓶中,加50mL0.1mol/L盐酸,搅拌直到颗粒物分散均匀。
用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口,置于高压锅内高压水解,10.3×104Pa30min。
水解液冷却后,滴加1mol/L氢氧化钠,取少许水解液,用0.4g/L溴甲酚绿检验呈草绿色,pH为4.5。
试样的酶解
a.含有淀粉的水解液:
加入3mL10%淀粉酶溶液,于37℃~40℃保温约16h。
b.含高蛋白的水解液:
加3mL10%木瓜蛋白酶溶液,于37℃~40℃保温约16h。
过滤
上述酶解液定容至100.0mL,用干滤纸过滤。
此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
⑵氧化去杂质
视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液及核黄素标准使用液(约含1μg~10μg核黄素)分别于20mL的带盖刻度试管中,加水至15mL。
各管加0.5mL冰醋酸,混匀。
加30g/L高锰酸钾溶液0.5mL,混匀,放置2min,使氧化去杂质。
滴加3%双氧水溶液数滴,直至高锰酸钾的颜色退掉,剧烈震摇此管,使多余的氧气逸出。
⑶核黄素的吸附和洗脱
核黄素吸附柱:
称硅镁吸附柱约1g用湿法装入柱,占柱长1/2~2/3(约5cm)为宜(吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上),勿使柱内产生气泡,调节流速约为60滴/min。
过柱与洗脱:
将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后,用约20mL热水洗去样液中的杂质。
然后用5.00mL洗脱液将试样中核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中,再用水洗吸附柱,收集洗出之液并定容至10mL,混匀后待测荧光。
⑷标准曲线的制备
分别精确吸取核黄素标准使用液0.3mL、0.6mL、0.9mL、1.25mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL(相当于0.3μg、0.6μg、0.9μg、1.25μg、2.5μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg核黄素)或取与试样含量相近的单点标准按核黄素的吸附和洗脱步骤操作。
⑸测定
于激发光波长440nm,发射光波长525nm,测量试样管及标准管的荧光值。
待试样及标准的荧光值测量后,在各管的剩余液(约5mL~7mL)中加0.1mL20%低亚硫酸钠溶液,立即混匀,在20s内测定各管的荧光值,作试样的空白值和标准的空白值。
5.结果计算
式中X—样品中含核黄素的量,mg/100g;
A—样品管荧光值;
B—样品管空白荧光值;
C—标准管荧光值;
D—标准管空白管荧光值;
F—稀释倍数;
m—样品的质量,g;
m0—标准管中核黄素的含量,μg;
100/1000——将样品中核黄素量由μg/g折算成mg/100g的折算系数。
6.说明及注意事项
⑴核黄素对光敏感,整个操作应在避光条件下进行。
⑵核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型,但摇动后很快被空气氧化成有荧光物质,所以要立即测定。
⑶试样提取液中若有色素,可吸收部分荧光,因此要除去色素(用高锰酸钾氧化)。
⑷在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
(二)微生物法
1.原理
某一种微生物的生长(繁殖)必需某些维生素。
例如干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei,简称L.C.)生长需要核黄素,培养基中若缺乏这种维生素该细菌就不能生长。
在一定条件下,该细菌生长情况,以及它的代谢物乳酸的浓度和培养基中该维生素含量成正比,因此可以用酸度及混浊度的测定方法来测定试样中核黄素的含量。
2.试剂
⑴盐酸(0.1mol/L);
⑵冰乙酸;
⑶氢氧化钠溶液(1mol/L和0.1mol/L);
⑷氯化钠溶液(生理盐水,0.9g/L):
使用前应进行灭菌处理;
⑸无水乙酸钠;
⑹氢氧化铵;
⑺乙酸铅;
⑻干酪乳杆菌(LactobacilluscaseiATCC7469);
⑼甲苯;
⑽核黄素标准储备液(25μg/mL)
将标准品核黄素粉末结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。
经过24小时后,准确称取50mg,置于2L容量瓶中,加入2.4mL冰乙酸和1.5L水。
将容量瓶置于温水中摇动,待其溶解,冷至室温,稀释至2L,移至棕色瓶内,加少许甲苯盖于溶液表面,于冰箱中保存;
⑾核黄素标准中间液(10μg/mL)
准确吸取20mL标准储备液,加水稀释至50mL;
⑿核黄素标准使用液(0.1μg/mL)
准确吸取1.0mL中间液于100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。
每次分析要配制新标准使用液;
⒀碱处理蛋白胨
分别称取40g蛋白陈和20g氢氧化钠于250mL水中。
混合后,放于37℃±0.5℃恒温箱内,24h~48h后取出,用冰乙酸调节pH至6.8,加14g无水乙酸钠(或23.2g含有3分子结晶水的乙酸钠),稀释至800mL,加少许甲苯盖于溶液表面,于冰箱中保存;
⒁胱氨酸溶液(1g/L)
称取1gL-胱氨酸于小烧杯中。
加20mL水,缓慢加入约5mL~10mL盐酸,直至其完全溶解,加水稀释至1L,加少许甲苯盖于溶液表面;
⒂酵母补充液
称取100g酵母提取物干粉于500mL水中,称取150g乙酸铅于500mL水中,将两溶液混合,以氢氧化铵调节pH至酚酞呈红色(取少许溶液检验)。
离心或用布氏漏斗过滤,滤液用冰乙酸调节pH至6.5。
通入硫化氢直至不生沉淀,过滤,通空气于滤液中,以排除多余的硫化氢。
加少许甲苯盖于溶液表面,于冰箱中保存;
⒃甲盐溶液
称取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾,加水溶解,并稀释至500mL。
加入少许甲苯以保存之;
⒄乙盐溶液
称取10g硫酸镁(MgSO4·7H2O),0.5g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和0.5g硫酸锰(MnSO4·4H2O),加水溶解,并稀释至500mL,加少许甲苯以保存之;
⒅基本培养储备液
将下列试剂混合于500mL烧杯中,加水至450mL,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8,用水稀释至500mL
碱处理蛋白胨 100mL
0.1%胱氨酸溶液 100mL
酵母补充液 20mL
甲盐溶液 10mL
乙盐溶液 10mL
无水葡萄糖 10g
⒆琼脂培养基
将下列试剂混合于250mL三角瓶中,加水至100mL,于水浴上煮至琼脂完全溶化,用1mol/L盐酸趁热调节pH至6.8。
尽快倒入试管中,每管3mL~5mL,塞上棉塞,于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min,取出后直立试管,冷至室温,于冰箱中保存;
无水葡萄糖 1g
乙酸钠(NaAc·3H2O) 1.7g
蛋白胨 0.8g
酵母提取物干粉 0.2g
甲盐溶液 0.2mL
乙盐溶液 0.2mL
琼脂 1.2g
⒇溴甲酚绿指示剂(0.4g/L)
称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中,加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨,加少许水,继续研磨,直至完全溶解。
用水稀释至250mL;
(21)溴麝香草酚蓝指示剂(0.04%)
称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵中,加1.6mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨。
加少许水,继续研磨,直至完全溶解,用水稀释至250mL。
3.仪器与设备
⑴实验室常用设备;
⑵电热恒温培养箱;
⑶离心沉淀机;
⑷液体快速混合器;
⑸高压消毒锅。
4.菌种的制备与保存
⑴储备菌种的制备
以L.C.纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中。
在37℃±0.5℃恒温培养箱中保温16h~24h。
贮于冰箱内,至多不超过2周,最好每周移种一次。
保存数周以上的储备菌种,不能立即用于制备接种液,一定要在使用前每天移种一次,连续2d~3d方可使用,否则生长不好。
⑵种子培养液的制备
取5mL核黄素标准使用液和5mL基本培养储备液于15mL离心管混匀,塞上棉塞,于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min。
每次可制备2管~4管。
5.操作步骤
因核黄素易被日光和紫外线破坏,故一切操作要在暗室内进行。
⑴接种液的制备
使用前一天,将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中,同时制做两管。
在37℃±0.5℃保温16h~24h。
取出后离心10min(3000r/min),以无菌操作方法倾去上部液体,用已消毒的生理盐水淋洗二次,再加10mL消毒生理盐水,在液体快速混合器上振摇试管,使菌种成混悬体。
将此液倾入已消毒的注射器内,立即使用。
⑵试样的制备
将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。
称取约含5μg~10μg的核黄素样品(谷类约10g,干豆类约4g,肉类约5g),加入50mL0.1mol/L盐酸溶液,混匀。
置于高压锅内,在10.3×104Pa压力下水解30min。
冷至室温,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.6(取少许水解液,用溴甲酚绿检验,溶液呈草绿色即可)。
加入淀粉酶或木瓜蛋白酶,每克样品加入20mg酶。
在40℃恒温箱中过夜,大约16h。
冷至室温,加水稀释到100mL,过滤。
对于脂肪量高的食物,可用乙醚提取,以除去脂肪。
⑶标准管的制备
三组试管中每管各加核黄素标准使用液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL,每管加水至5mL,再每管加5mL基本培养储备液混匀。
⑷试样管的制备
吸取试样溶液5mL~10mL,置于25mL具塞试管中,用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至6.8(取少许溶液,用溴麝香草酚蓝检验),加水稀释至刻度。
取两组试管,各加试样稀释液1,2,3,4mL,每管加水至5mL,每管再加5mL基本培养储备液混匀。
⑸灭菌:
将以上样品管和标
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