GPR3基因敲除小鼠的构建.docx
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GPR3基因敲除小鼠的构建
硕士学位论文
Adissertationsubmittedto
TongjiUniversityinconformitywiththerequirementsfor
thedegreeofMasterofScience
、
March,2014
GPR3基因敲除小鼠的构建邢明哲同济大学
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年月日
摘要
G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs),又称为7次跨膜受体(seven-transmembranereceptors),是细胞表面最大的受体蛋白质超家族,广泛地参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等各类生理活动的调控。
G蛋白偶联受体3(Gprotein-coupledreceptor3,GPR3)是一种孤儿受体,近期研究提示它直接或者间接参与调节脊椎动物神经系统及卵泡的发育过程,同时GPR3参与了老年痴呆症等神经退行性疾病的发生。
因而GPR3是一个潜在的治疗多种神经疾病和卵巢早衰的药物靶标,它的生理功能及作用的分子机制等都值得进一步研究。
基于此,本论文的主要内容就是利用TAL效应核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)技术构建GPR3敲除小鼠和GPR3条件性基因敲除小鼠。
本研究针对GPR3基因,设计了数对靶向TALEN,构建了TALEN打靶载体,以BL6/C57品系为对象,通过受精卵原核注射TALENsmRNA,对新生小鼠(Founders)进行PCR、酶切和测序鉴定,成功获得了因缺失14个碱基而导致开放性读码框移码的GPR3敲除小鼠,为GPR3蛋白的功能及药物靶点的研究提供整体水平上的研究模型。
关键词:
G蛋白偶联受体,GPR3,转录激活因子样效应物核酸酶,基因敲除,小鼠
ABSTRACT
Gprotein-coupledreceptors(GPCRs),alsoknownasseven-transmembranereceptors,constitutethelargestfamilyofcellsurfacereceptorsandareinvolvedinvariousbiologicaleventsincludingcellgrowth,differentiation,migrationandapoptosis.GPR3isanorphanGPCRwhichisrecentlydiscoveredtobeimportantinbothvertebratenervoussystemandfollicledevelopment.GPR3wasalsoreportedtobeinvolvedinthepathogenesisofAlzheimer'sdisease.Therefore,GPR3isapotentialtherapeutictargetforAlzheimer’sdiseaseandfollicledysfunction.However,thedetailedsignaltransductionandmolecularmechanismsgovernedbyGPR3stillremainunclearandneedtobefurtherinvestigated.Basedonabove,thepresentstudyaimstogenerateGPR3knockoutmiceusingtranscriptionactivator-likeeffectornuclease(TALEN).WedesignedandconstructedseveralpairsofTALENstargetingGPR3gene.TheTALENmRNAsweremicroinjectedintoone-cellembryoofBL6/C57mouse.Thebornpups(Founders)wereanalyzedbyPCR,enzymedigestionandsequencingtoidentifymicewithcorrecttargetingsequence.Finally.amousewith14-nucleotidedeletionwithintheGPR3generegionwereobtained.SuchdeletionsledtoGPR3knockoutduetoanopenreadingframeshift.TheGPR3KOmousewillprovideusausefultooltoinvestigatethedownstreamsignaltransductionandthephysiologicalandpathologicalroleofGPR3.
KeyWords:
G-proteincoupledreceptors,GPR3,TALEN,Geneediting,Mouse
第1章引言
1.1G蛋白偶联受体的概述
G蛋白偶联受体(GProtein-CoupledReceptor,GPCR),是人体内最大的细胞表面受体蛋白家族,大约包含1000个成员。
这类受体的共同点是其高级结构中都有七个跨膜α螺旋,所以又称7个α螺旋跨膜蛋白受体(seven-α-helicestransmembranesegmentreceptor,7TMreceptor)。
到目前为止,研究发现G蛋白偶联受体只见于真核生物之中,并且参与了大量的细胞信号转导过程。
GPCR通过感受细胞外的诸如气味、光线、激素、细胞因子和神经递质等信号刺激并将其跨膜传递到细胞内,GPCRs激活并启动下游信号通路,从而广泛地参与细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和血管新生等各类生理活动的调控[1-8](图1.1)。
更为重要的是,GPCRs还在多种重要疾病中扮演关键的角色,因而一直是各大药物研发机构所关注的最具开发潜力的药物作用靶点,目前以GPCRs为靶点的药物几乎占市场销售药物的4成以上[9-12]。
图1.1G蛋白偶联受体在调节细胞生理功能中的多样性。
各种配体和外来刺激诸如生物胺、氨基酸、离子、脂类、蛋白质和多肽等通过与GPCRs结合,并以G蛋白依赖或不依赖的方式激活胞浆和核内的下游信号通路,以此调控细胞的增殖、分化、迁移、凋亡和血管新生等各类生理活动。
1.1.1G蛋白偶联受体的结构
GPCRs的肽链结构包括胞外的N末端、7个α螺旋的跨膜结构、3个胞外环、3~4个胞内环和胞内的C末端。
每个跨膜区的肽段通常由20~27个疏水性氨基酸残基组成,这些疏水性氨基酸残基组成的肽段在跨膜区中以α螺旋的形式存在;N末端位于细胞外,有7~597个氨基酸残基,其上有N-糖基化位点;C末端伸向细胞内,有12~359个氨基酸残基,其上有磷酸化位点;胞内和胞外环各有5~230个氨基酸残基,当C末端的半胱氨酸被棕榈酸酰化后会形成第四个胞内环[13,14]。
序列分析发现,不同GPCRs的N、C末端和胞内、外环氨基酸序列的差异较大,而在7次跨膜疏水区域处则相对保守。
目前人们对于G蛋白偶联受体结合配体之后究竟会发生如何的构象变化还不是很清楚。
但是,大家更倾向于认为G蛋白偶联受体有一个在激活和非激活状态之间的平衡状态,所以配体的结合就是把平衡态往激活或者非激活的方向引导而已。
所以,GPCR的配体又可以被分为三大类:
让受体平衡状态朝着激活方向移动的激动剂;让受体朝着非激活状态方向移动的反兴奋剂;和不影响平衡的中性拮抗剂。
图1.2G蛋白偶联受体的初级结构模式图。
G蛋白偶联受体镶嵌在双层脂膜中,从胞外到胞内依次包括N末端、3个胞外环(E1-3)、7次螺旋跨膜区、3~4个胞内环(I1-4)和C末端。
1.1.2G蛋白偶联受体的空间结构
由于GPCRs是跨膜蛋白,因此不易得到晶体,难以用X射线、NMR等方法检测其三维结构。
自从首个GPCR(牛Rhodopsin)被分离并解析出初级结构后的十多年里[15-17],关于GPCRs空间结构的研究一直进展缓慢。
直到2000年,K.Palczewski等解析出了第一个GPCR(牛Rhodopsin)的精细结构,分辨率达2.8A,进一步证实了GPCRs是7次螺旋跨膜结构的预测[18]。
2007年第一个人β2肾上腺素受体(β2AR)的精细空间结构又被成功解析出来[19],该空间结构显示β2AR可能以二聚体的形式存在,两个单体之间以胆固醇和棕榈酸相连并一起镶嵌于双层脂膜中,同时β2AR的扩散性配体carazolol也被发现与受体结合在一起(图1.3)。
随着新型蛋白重组表达方法的建立以及新型去垢剂、膜蛋白纯化和结晶技术的发展,迄今为止已经有超过75种结构包含18个不同GPCRs的晶体结构被解析出来,为进一步解析更多的GPCRs精细结构以及个性化的药物研发和治疗奠定了基础[20]。
1.1.3G蛋白偶联受体的分类
GPCRs按序列和结构的相似性主要分为A、B、C三大家族,各自所占总体的比例分别为89%、7%和4%[21](图1.4)。
A类家族拥有的GPCRs数量最多,也被称为视紫红质/β2肾上腺素受体样GPCRs,主要的配体有气味分子、神经肽类和激素以及多巴胺和5-羟色胺等重要的神经递质。
A类GPCRs的一级结构有以下特征:
N末端氨基酸残基数较少;在7次螺旋跨膜区处有多个高度保守的氨基酸残基;第1和第2个胞外环之间以二硫键相连;C末端有棕榈酰化的半胱氨酸,可形成第四个胞内环。
B类家族又被称为胰高血糖素样GPCRs,重要的配体有胰高血糖素、分泌素和甲状旁腺等激素。
它们的一级结构有以下特征:
N末端较长,可达到100多个氨基酸残基,其中含有几个半胱氨酸形成的二硫键网格结构;7次螺旋跨膜区的保守氨基酸残基与A类GPCRs不同;C末端缺失棕榈酰化。
C类家族又被称为促代谢型神经递质样GPCRs,它们的一级结构有以下特征:
N末端和C末端均较长;除了在第一和第二胞外环之间有二硫键外,与其他两类GPCRs没有序列和结构上的相似性;第三个胞内环很短且高度保守[22]。
此外,按系统和种系发生GPCRs可被分为5个亚家族,分别是:
谷氨酸盐受体类、视紫红质受体类、粘附受体类、fizzled/taste2受体类和分泌素类[23]。
图1.3G蛋白偶联受体家族的分类和结构模式图。
A类的7次螺旋跨膜区呈倾斜和扭结状(titledandkinked),红色圆圈代表A类GPCRs的保守氨基酸残基;B类的特点是胞外较长的N末端,并含有大量保守的半胱氨酸形成的二硫键网格结构;C类拥有较长的N末端和C末端,但其7次螺旋跨膜结构的排序和方向仍未可知。
1.2G蛋白偶联受体3的概述
G蛋白偶联受体3(Gprotein-coupledreceptor3,GPR3)是GPCRsA类大家族中的一员,具有典型的7次跨膜螺旋结构域,属于视紫红质样受体亚家族。
在小鼠上的研究已经发现,GPR3能够通过Gs蛋白介导的信号通路调控神经系统发育[24,25]和卵母细胞的减数分裂阻滞[26]。
小鼠GPR3基因由两个外显子和一个内含子组成,第一个外显子仅含5’非编码区,第二个外显子则包含了3’非编码区和整个编码区。
GPR3基因在进化过程中高度保守,氨基酸序列对比分析发现,小鼠、猪以及短尾猊与人类GPR3的同源性分别为93%、95%和83%。
GPR3蛋白大小约为35.4kDa,它的氨基酸含有一个N连接的糖基化位点(N-linkedglycosylationsite),羧基端有数量不定的磷酸化位点,在第二胞内环和第三跨膜区的交界处含有保守的DRY(Asp–Arg–Tyr)基序[27]。
这些修饰位点对于GPCR蛋白的结构和功能具有很重要的作用。
1.2.1GPR3的组织分布
前人已经对GPR3的组织分布做了详细的研究。
首先,利用RT-PCR和Northern技术发现GPR3基因在小鼠的睾丸中低水平表达,在神经系统中大量表达,而在其他部位(肺、肾、肠心、肝、脾)未见表达[27]。
Eggerickx等[28]利用核糖核酸酶测定法(RNaseprotectionassays)同样的检测了小鼠GPR3的mRNA的组织分布情况,发现其仅在脑中大量表达,而在睾丸、卵巢和眼睛低水平表达,但在胃、肠、心、肝、脾、肺、附睾、精囊、淋巴、大动脉、肾上腺、胸腺、骨髓、脂肪和皮肤中未见表达,这一发现与Saeki等的结果一致。
近年来,Mehlmann等[26]人也利用了原位杂交技术研究了GPR3mRNA在小鼠卵巢组织中的分布情况,他们发现GPR3主要表达于卵母细胞,表达量约是卵泡体细胞的14倍左右。
前不久,Tanaka[29]等人利用Real-timePCR技术在小鼠组织中检测GPR3mRNA表达量时发现,它不仅在脑组织和睾丸中大量表达外,而且在心脏、肾脏和骨骼肌中亦有少量的表达。
1.2.2GPR3的配体
GPR3具有较高的组成性活性。
过表达GPR3受体能在不添加任何配体的情况下显著提高多种细胞内的cAMP水平。
已有研究发现,hGPR3转染HEK293细胞后,添加S1P及DHS1P能够使GPR3进一步的激活,并且S1P还能够诱导GPR3亚家族成员Gpr6的内化,这一发现表明S1P及其代谢产物可能是GPR3受体的潜在配体[31]。
Hinckley等[32]人利用EST数据库搜索、GV期卵母细胞mRNAs微列阵分析、和RT-PCR扩增3种独立的策略研究发现,GPR3、EDG3、Gpr12这三者的表达密切相关,并且鞘氨醇及其代谢产物被鉴定为其潜在配体。
将小鼠的卵母细胞在GPR3/12潜在配体SPC和S1P中孵育,可以延迟卵母细胞的自发成熟。
另外,在体外培养小鼠卵母细胞过程中,添加100或500nmol/L的S1P有利于卵母细胞的成熟、受精及受精卵的形成。
1.3GPR3的功能
1.3.1GPR3促进神经突的生长
近几年科学家研究发现,GPR3可以使小鼠小脑颗粒神经元的cAMP水平提高,并且促进神经突的生长[33]。
在神经元传递信号转导的过程中,神经突发挥了十分重要的作用,但是目前科学家对神经突出的研究还不够深入,只是发现神经突须具备一定浓度的cAMP才能维持生长,仍然不清楚其中的调控机制。
GPR3在大鼠小脑颗粒神经元中一直保持着高表达,前人已经发现利用siRNA减少细胞内源性的GPR3能够抑制神经突的生长;但如果转入外源GPR3,被抑制的神经突又会恢复生长[33]。
此外,在神经元中表达Gpr12(GPR3亚家族的成员),可以通过降低髓磷脂对神经突生长的抑制,从而起到促进神经突生长的作用[33]。
1.3.2GPR3调节β淀粉样肽的产生
β淀粉样蛋白(Aβ)假说是关于阿尔茨海默症发病原因最主要的假说,该假说认为,在阿尔茨海默症发病的过程中,淀粉样蛋白斑块的主要成分Aβ起着决定性作用。
Aβ是I型跨膜蛋白淀粉样蛋白前体蛋白APP经过β-分泌酶和γ分泌酶顺序剪切后的产物。
一项2009年的高通量基因组功能研究证明[24],GPR3能够调剂Aβ的生成,他们发现这一受体的过表达都能增强γ分泌酶的组装,从而导致Aβ的积累,但若通过遗传学手段敲除GPR3受体,AD模型小鼠的海马体内Aβ就会降低。
值得关注的是,GPR3受体对Aβ产生过程的调节不会影响Notch的剪切,这也暗示,GPR3不仅通过组装Aβ分泌酶复合体来发挥调节作用,还可能通过其他方式影响Aβ的产生。
1.3.3GPR3抑制小脑颗粒细胞的增殖
在出生后的啮齿类动物小脑发育过程中,GPR3起到抑制小脑颗粒细胞增殖的作用[34]。
研究发现,在大鼠的小脑颗粒神经元中,表达外源性的GPR3能够局部对抗Shh(Sonichedgehog,刺猬蛋白)增殖作用,而利用RNAi敲减GPR3后,则加强了Shh诱导的CGP(Cartilageglycoprotein,软骨糖蛋白)的增殖。
此外,p27/kip1是调节颗粒细胞前体增殖的另一重要因子。
它在发育的小脑中大量表达,可以促进CGPs退出细胞周期,对抗Shh的增殖作用[35]。
在CGPs中表达外源性的GPR3能够增加p27/kip的表达,而敲减GPR3则降低了p27/kip的表达量。
这更加证明了GPR3具有抑制小脑颗粒细胞增殖的作用。
1.3.4GPR3调控小鼠的情绪样行为
情绪行为主要由位于大脑缰部、海马、杏仁核、皮质及边缘系统中的情绪中枢控制,cAMP信号通路的改变会导致情绪行为的紊乱[36]。
GPR3能够调节神经细胞内的cAMP水平,并且在大脑的缰部、海马和皮质部大量表达[37]。
而这些部位恰恰与应激行为紧密相关,通过行为分析可以发现,在无应激状态下,GPR3的缺失没有影响小鼠正常的运动和协调能力;但在应激条件下,GPR3缺失使小鼠表现出情绪异常。
它们不仅抵触陌生环境,情绪焦虑不安,并且攻击性增强[38];另一方面,野生型小鼠则更耐受应激条件,还能主动回避不良的环境。
由此可见,GPR3缺失的小鼠应对外界刺激的能力下降,情绪易波动。
情绪反应往往受到下丘脑-垂体-肾上腺轴激素(如皮质酮)和单胺类神经递质传递的影响。
此外,最新研究发现[39],GPR3的信号通路还参与了可卡因早期的成瘾过程。
1.3.5GPR3参与调节神经性疼痛及吗啡诱导的抗痛作用。
神经性疼痛是指由中枢或外周神经系统原发性病变或功能障碍引起的疼痛综合征,可由外伤或疾病导致的神经或周围组织损伤而引发。
周围神经损伤通常能够改变神经胶质细胞和星形细胞的形态,增加CD11b、Iba1和GFAP等小神经胶质标记基因的表达,并且激活神经小胶质细胞产生并释放一系列的致痛因子作用于神经元传递疼痛。
研究表明,GPR3能够调节外周神经损伤导致的神经性疼痛。
与野生型小鼠相比,GPR3缺失小鼠在外周神经受到损伤后,表现出对温热刺激的过敏反应,并对吗啡抗痛作用的反应性降低,但是没有影响其对机械性异常疼痛的反应以及坐骨神经损伤引起的脊髓炎症反应[25]。
当小鼠脊髓背侧角的神经结扎后,GPR3缺失和野生型小鼠的小神经胶质细胞和星形细胞的形态并未呈现明显不同,说明其疼痛的传递可能通过其他的途径进行。
1.3.6GPR3在卵泡发育及卵母细胞成熟中的作用
近几年,研究人员对GPR3及其介导的信号通路进行了大量基础性研究,发现GPR3对卵母细胞成熟及减数分裂前期阻滞极其重要。
研究人员发现,在CHO-K1、COS-7、NIH3T3等细胞系中,AC能被转染GPR3的表达载体持续激活,而细胞内的cAMP水平也能被其提高[28]。
之后,Mehlmann等人[40]研究发现,在卵母细胞中,维持其减数分裂阻滞的关键因子是Gs蛋白。
而通过小鼠卵母细胞中Gi和Gq家族抑制性对比实验,发现Gi和Gq都无法引发GVBD,这更加证明了在小鼠卵母细胞中,Gs活性对其维持减数分裂前期阻滞必不可少。
在脱离卵泡的长足的卵母细胞中加入磷酸二酯酶的抑制剂次黄嘌呤,依然能保持其减数分裂的阻滞,说明如果防止分离的卵母细胞中cAMP自身水解,Gs的活性足以使cAMP维持在保持减数分裂阻滞状态的水平。
然而,Gs具有很少的持续活性,要想维持这种活性,需要在卵母细胞膜上存在持续激活Gs的GPCRs[26]。
这一受体须具备持续的组成活性,或者能够被周围卵泡体细胞产生的配体所激活。
研究人员通过对EST数据库进行筛选,在卵母细胞中发现了15条EST序列,其中就包括GPR3。
而这一受体最为引发关注,它能提高细胞内的cAMP水平[28],研究人员据此推测其与Gs蛋白偶联,维持卵母细胞减数分裂的阻滞。
图1.4维持排卵前卵泡中卵母细胞减数分裂的前期阻滞模式图
1.3.7GPR3在疾病治疗中的潜在作用
随着疾病分子机制研究的深入发展,人类发现了越来越多的药物筛选靶标。
目前研究最成功也最大的一类蛋白质药物靶点是GPCRs,近五成的药物通过它来发挥作用。
药物靶点筛选与GPCRs的功能密切相关,GPR3因其特殊的表达模式以及对神经和卵巢发育的重要作用,被列为治疗神经及生殖系统有关疾病的潜在靶标。
研究发现,GPR3具有调节神经元中β淀粉样肽产生和淀粉样蛋白斑形成的作用[24],脑组织中GPR3的积累是产生阿尔茨海默病的主要原因?
。
另外,它还能调节外周神经损伤导致的神经性疼痛和吗啡诱导的抗痛作用[25]。
因此可以推断,GPR3能够作为治疗阿尔茨海默病及神经性疼痛的潜在药物靶标。
还有研究发现,GPR3的不足导致了小鼠卵巢早衰,并丧失了生殖力[41],这从另外一方面为卵巢早衰机理研究及其治疗药物的筛选提供了可资借鉴的动物模型。
1.4TALEN的概述
继锌指核酸酶(zinc-fingernuclease,ZFN)技术之后,TAL效应核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)是另一种能够对动植物细胞基因组进行高度特异和高效定点修饰的新兴技术,备受众多科学家青睐。
TALEN技术是根据从植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的一种转录激活子样效应因子(transcriptionactivator-likeeffectors,TALE)发展而来的新型的靶向基因操作技术。
TALEN技术不仅具备了ZFN技术特异结合目标DNA特异性的优点,同时也消除了它的某些缺点。
与传统方法相比,TALEN技术具有很高的打靶效率,一般在60%左右,甚至更高,大大减少了构建基因敲除动物模型的工作量[42];另外,它还具有无基因序列、细胞、物种限制等多种优点,实验设计简单准确、实验周期短、成本低等等。
目前,TALEN技术已经在大鼠、小鼠、猪、斑马鱼、水稻、拟南芥及酵母等[43-46]多类物种中得到成功应用。
1.4.1TAL效应核酸酶(TALEN)的结构
TALEN的组成部分包括中央DNA结合域、N端分泌信号、还有1个核定位信号和C端FokI内切酶的切割区域。
其中最为重要的便是FokI的切割域和类似转录激活物作用的DNA特异性识别序列[47]。
1.4.1.1TALEN的识别结构域
TALE是一种在植物病原菌黄单胞菌属Xan-thomonas中发现的菌体蛋白。
1992年就有研究表明,该类病原微生物可以通过T3S(typeIIIsecretions
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