三种景观树种的组培技术研究 张作玲.docx
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三种景观树种的组培技术研究张作玲
三种景观树种组织培养技术研究
摘要:
本研究针对三种景观树种(红叶石楠、蓝花楹、红花七叶树)的组织培养的各个环节进行试验行研究。
结果表明:
红叶石楠:
表面灭菌以二次灭菌4+3.5min较好成活率,达到了85%,启动培养基以MS+6-BA1.0mg/l(单位以下相同)+NAA0.2最好分化率达到100%。
适宜的增殖培养基为MS+NAA0.1+6-BA2.0,增殖系数为7.2。
生根培养;以1/2MS+NAA0.1的生根培养基效果最好。
蓝花楹:
适宜的启动培养为B5+6-BA1.0+2,4-D0.2+NAA0.3成活率达到100%。
增殖培养;以MS+6-BA2.0+NAA0.3的培养基较好,增殖率可达5.4%。
红花七叶树:
表面灭菌以8min较好成活率达到了88.8%,启动培养MS+6-BA0.5的愈伤组织诱导最好,长愈伤率为100%。
关键词:
红叶石楠;蓝花楹;红花七叶树;组织培养
TissueCultureofthreeLandscapeofTrees
Abstract:
ThemicroprogationtechniquesofthreeLandscapeofTreeswerestudiedinthispresent.Theresultsshowedthatafterbeingsterilizedin70%alcoholfor30sandthenin0.1%HgCl2for4+3.5minforshoottipof,PhotiniaFraseri.thepollutionandthebrowningrateoftheexplantsreachedaratherlowlevelandthelivingratereached85%.TheMSbasicmediumsupplementedwith1.0mg/L6-BA,0.1mg/LNAAwasthebestinitiationmedium.TheMSbasicmediumsupplantedwith2.0mg/L6-BA,0.2mg/LNAAwasthebestmultiplicationmedium,inwhichthecoefficientofgerminationwas7.2.TherootingmediumforPhotiniaFraseriwas1/2MSbasicmediumsupplementedwith0.1mg/LNAA,0.7%agar,2%sucrose,andthepHofthemediumwas6.0.ThebestinitiationmediumforJacarandamimosifoliawastheB5basicmediumsupplementedwith1.0mg/L6-BA,0.2mg/L2,4-Dand0.3mg/LNAA,inwhichthelivingratereached100%.Thebeststerilizedtimewas8mininHgCl2andthelivingratereached88.8%andthebestexplantswaslittlepetioleforAesculuscarneaBriotii.ThebestinitiationmediumofcallusforAesculuscarneaBriotiiwastheMSbasicmediumsupplanted0.5mg/L6-BA,andthegerminationratewas100%.
Keywords:
Photiniafraseri;Jacaranda;AesculuscarneaBriotii;tissueculture
1前言
随着人类社会对生态环境建设的关注热情不断高涨,人们对园林景观树种的多样性选择也表现出极大的兴趣。
为了在绿化人居环境的基础上进一步美化生活、丰富景观,彩色树种的选择与应用已成为当今国际范围内风景园林建设中的时尚潮流。
就中国而言,近几年从欧美各国引种栽培的彩色园林树种就达数十种之多,这在提升我国园林绿化建设水准和文化内涵等方面显示了卓越的成效,其产业化开发的经济效益与社会效益均十分显著。
我国园林绿地建设中原有的自闭、落后局面正在被打破,彩色园林树种的推广应用正在迅疾兴起,呈现出一片可持续发展的广阔前景[1]。
红叶石楠(PhotiniaFraseri)是蔷薇科石楠属常绿灌木或小乔木[2],为近年从国外引进的彩叶绿化用树种。
其新梢和嫩叶鲜红,色彩艳丽持久,成熟叶叶色浓绿,有光泽极具生机。
因此成为全球绿化树种中最为时尚的红叶的系列树种,在欧美国家和日本已被广泛应用,被誉为“红叶绿篱之王”。
我国园林绿化中常绿或半常绿的红叶树种极少,红叶石楠可填补这一不足,目前在国内仅有少量红叶石楠种苗供应市场,远远不能满足苗圃和园林工程应用的需求。
因此,该树种市场前景广阔,发展潜力[3]。
蓝花楹(Jacarandamimosifolia),别名:
巴西紫葳,属于紫葳科(Bignoniaceae),蓝花楹属(Jacaranda)。
原产中南美洲,分布于墨西哥、南非、巴西、西印度群岛、秘鲁、坡利维亚等国。
蓝花楹很奇特,它的叶子很象合欢,二回羽状复叶,对生。
花色为蓝色,花冠联合钟状,果实象乌龟壳。
它是一种优良的观叶、观花还可观果的树种,特别是观蓝色花的景观树种。
目前,蓝花楹已广布世界上很多地方,我国南方大部分地区都有引种,如广东、海南、广西、福建、云南、四川等[4]。
并且在栽植范围呈不断扩大的趋势。
红花七叶树(AesculuscarneaBriotii),七叶树科(Hippocastanaceae),七叶树属,落叶乔木,树叶掌形复叶,小叶通常5枚,成树5-7枚,叶片长7.5-15cm,在春季新叶初上时,叶色殷红如血,十分艳丽。
在夏季的时候,也会因为树叶的不同长势而呈现多色,上部微红,中间嫩绿,下部墨绿,到了秋季,叶色澄黄如金,故又有变色木之称。
树体通直,十分伟岸。
4-5月开花,开花时,红色圆锥形花序缀满树冠,绿树红妆,能达到“万绿丛中一点红,动人春色无须多”的意境。
因此,红花七叶树成为良好的观花观叶景观树种,适用于人行步道,公园,广场绿化,孤植或成行栽植都可。
初步被认定为理想的绿化树种。
和杂交马褂木、红豆杉、北海道黄杨同属奥运指定苗木。
以上三种景观树种的市场发展前景广阔。
红叶石楠品种群因引种数量有限,限制了其推广和应用。
蓝花楹和红花七叶树均可用种子繁殖,但是种源来自国外,费用昂贵。
且蓝花楹种子发芽率仅5%左右[4],而红花七叶树的种子属顽拗型种子,不耐失水和低温,自然风干10天就会因失水丧失发芽力[5];结实大小年现象明显;容易霉烂、遭鼠害等[6]。
这些因素严重影响了市场苗木的供应。
因常规育种方法严格受到季节时间的限制,不能在短期内获得大量苗木,无法满足市场的需求,而组织培养具有用材少、周期短、繁殖效率高等优点,对加速繁殖,提高经济效益,解决种苗严重供不应求的实际问题都有重要意义[7]。
因此本文就红叶石楠、蓝花楹、红花七叶树的组织培养进行了试验性的研究。
2红叶石楠的组织培养
2.1材料与方法
2.1.1实验材料
实验材料来源于江苏农林职业技术学院北校区,截取当年生新梢作外植体。
2.1.2试验方法
2.1.2.1材料处理
晴天中午,采集红叶石楠当年生枝条的幼嫩茎尖和茎段,将茎尖和茎段剪成5cm长,用洗衣粉浸泡5min左右再用自来水冲洗20min以备用。
2.1.2.2启动培养
将冲洗干净的红叶石楠外植体剪成1-2cm大小的茎尖或带一个单芽的茎段,用75%的酒精浸泡30s,再用0.1%升汞消毒,分别采用不同的灭菌时间进行试验,灭菌时间分别为:
6,6.5,7,7.5,8,3+3,4+3,4+3.5,4+4分钟。
最后用无菌水冲洗3-4次,以最大限度地减少HgCl2残毒对外植体的影响。
在超净工作台上接种前先剥去顶芽最外层的一片幼叶,并部分地切去茎段的两端,保留茎段长约1cm左右,直立式接种,将外植体基部插入培养基。
每个处理接种30个材料。
20天后分别统计污染率、褐变率、存活率。
启动培养基采用MS基本培养基,并附加BA,KT,NAA,IBA等不同激素水平。
2.1.2.3增殖培养
在无菌条件下待诱导出的不定芽长到3-4cm时切剪下,接入增殖培养基(MS)中,附加不同种类、浓度的激素配比进行试验,试验因子为激素浓度,选择了6-BA(1.0mg/L,2.0mg/L,3.0mg/L)、NAA(0.1mg/L,0.3mg/L,0.5mg/L)两种激素,分别选取三个水平,共9种处理,每瓶接种3棵,每处理接种9瓶,重复三次,25天后统计分化数、苗高、苗生长状况。
2.1.2.4生根培养
当苗长到5cm左右时,剪成含3-4个小芽的小段,接种到不同生根培养基上诱导生根。
生根阶段,一般要求较低的无机盐离子浓度。
因此,本研究采用了(1∕4MS、1∕2MS、MS)的基本培养基,并附加蔗糖2.0%;琼脂0.7%;根、茎、芽对生长素的敏感性不同,其中,根最敏感。
因此,可通过增加培养基中生长素浓度来诱导生根。
本研究对影响红叶石楠生根的因素选取;两因子:
无机盐含量(1/4MS,1/2MS,MS),NAA(0.1mg/L,0.2mg/L,0.mg/L4)三水平的L9(34)正交试验设计,每瓶接种2个外植体,每次接10瓶,重复三次,30天后统计生根棵数、平均生根数、平均根长、生根率、根长势。
2.1.2.5培养条件
启动和增殖培养的培养基中附加蔗糖均为3%,琼脂为0.7%。
生根培养基加入2℅的蔗糖,0.7℅的琼脂。
PH值为5.8-6.0。
培养室温度白天为25-28℃,夜晚为15-20℃,光照强度1500-2000lx光照时间12h∕d。
2.2结果与分析
2.2.1启动培养
2.2.1.1外值体的表面灭菌(茎尖和茎段都有)
表1-1红叶石楠表面灭菌效果比较
灭菌时间(min)
接种数
污染数
死亡数
成活率
6
20
12
0
40%
6.5
20
9
0
55%
7
20
6
0
70%
7.5
20
6
2
60%
8
20
3
3
70%
8.5
20
1
4
75%
3+3
20
10
1
45%
4+3
20
6
0
70%
4+3.5
20
2
1
85%
4+4
20
1
3
80%
表1-1结果表明:
对外植体的表面灭菌总时间相同下,二次灭菌的死亡率和污染程度较一次灭菌明显降低。
无论一次灭菌还是二次灭菌,对于茎段培养只要超过7min,死亡会明显加重,这表明,HgCl2灭菌时间过长会把植物材料杀死,而灭菌时间过短,污染率又会上升,所以要权衡两方面的因素,选择适当的灭菌时间为4+3.5min较为适宜。
2.2.1.2培养基种类对启动培养的影响
表1-2不同培养基对启动培养的影响
培养基种类(mg/L)
接种数
分化数
分化率
6-BA0.5+NAA0.1
20
10
50%
6-BA0.5+NAA0.2
20
9
45%
6-BA0.5+NAA0.3
20
10
50%
6-BA1.0+NAA0.1
20
14
70%
6-BA1.0+NAA0.2
20
20
100%
6-BA1.0+NAA0.3
20
16
80%
6-BA1.5+NAA0.1
20
10
50%
6-BA1.5+NAA0.2
20
14
70%
6-BA1.5+NAA0.3
20
18
90%
外植体能否正常启动,在某种意义上说,它决定了组培能否正常进行下去,以及能否以最短的时间,最快的速度培养出优良苗木,以取得最佳的经济效益和社会效益。
红叶石楠启动过程中的培养基选择是组织培养成败的关键因素,培养基中植物激素的浓度对红叶石楠腋芽的萌发极为重要。
从表1-2中可以得出,6-BA和IBA对分化率的影响基本呈先增后减的趋势。
这是因为植物激素的浓度过低对不定芽生长分化不起作用,而高浓度又抑制了芽的生长。
所以,红叶石楠的适宜启动培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L。
2.2.2增殖培养
2.2.2.1激素浓度对红叶石楠增殖的影响
在增殖培养过程中,经过20天,从接种材料的基部不断有不定芽长出,但不同培养基配方的增殖效果不同。
从表中可以看出培养基MS+NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L进行增殖培养,其芽苗粗壮,增殖系数最高,增殖系数达7.2倍。
试验结果见表1-3
表1-36-BA和NAA浓度对红叶石楠增殖影响
NAA
(mg∕L)
6-BA
(mg∕L)
接种数
分化数
增殖系数
苗生长状况
0.1
1.0
27
136
5.0
叶色黄,叶片大小正常,茎粗。
0.3
1.0
27
138
5.1
叶色黄,叶片偏小,茎细,玻璃化。
0.5
1.0
27
108
4.0
叶色黄,叶片大小正常,茎细,玻璃化。
0.1
2.0
27
195
7.2
叶色浓绿,叶片大小正常,茎粗。
0.3
2.0
27
148
5.5
叶色绿,叶片大小正常,茎粗。
0.5
2.0
27
148
5.5
叶色绿,叶片大小正常,茎粗。
0.1
3.0
27
138
5.1
叶色绿,叶片偏小,茎细。
0.3
3.0
27
145
5.4
叶色黄,叶片偏小,茎细。
0.5
3.0
27
145
5.4
叶色黄,叶片大小正常,茎粗。
2.2.2.2不同取材部位对增殖的影响
分别将茎尖和茎段接入培养基中,结果发现茎尖和茎段相比有明显的优势,不仅芽萌动较早,苗的生长状态最佳,而且分化率和增殖系数较高。
结果显示不同取材部位影响红叶石楠的增殖,其中茎段增殖效果较好。
实验统计结果见表1-4。
表1-4不同外植体对增殖的影响
处理
接种数
分化率(℅)
增殖系数
分化数
苗生长状况
茎尖
102
98
5.3
537
叶色绿,叶片大小正常,茎粗。
茎段
90
100
5.6
504
叶色绿,苗粗壮。
从表1-4可以得出:
在红叶石楠的增殖培养中,茎段的增殖系数高于茎尖,茎尖为5.3,而茎段为5.6。
而在转接初期,茎段生长缓慢,茎尖生长旺盛。
但是随着培养时间的延长,二者的差距逐渐缩小。
茎段增殖率高于茎尖可能是由于茎尖的顶芽抑制了侧芽的萌发。
2.2.3生根培养
2.2.3.1无机盐含量和NAA浓度对红叶石楠生根的影响
幼苗转入不同生根培养基一周后,基部出现淡红色突起,长出带细密白色绒毛的根,根淡红色,30天后绒毛逐渐消失,根变为褐色并长出少量侧根。
本试验比较了无机盐含量和NAA浓度对红叶石楠幼苗生根的影响,结果见表1-5
表1-5红叶石楠在不同培养基上的生根情况
培养基
NAA(mg∕L)
接种数
生根数
平均根条数
平均根长(cm)
生根率(%)
根长势
1∕4MS
0.1
15
5
1.5
1.0
33.3
根粗壮,红色
1∕4MS
0.2
20
13
3.43
0.9
65
根细长,黄色
1∕4MS
0.4
15
10
2.2
1.7
66.7
根细长,黄色
1∕2MS
0.1
16
12
5.0
1.5
75
根粗壮,红色,须根发达
1∕2MS
0.2
15
11
3.5
1.3
73.3
根细长,黄色
1∕2MS
0.4
15
10
2.78
1.1
66.7
根细长,黄色
MS
0.1
20
12
1.8
1.8
60
根粗壮,红色,须根发达
MS
0.2
20
8
1.5
2.3
40
根粗壮,黄色,须根发达
MS
0.4
20
8
1.5
2.5
40
根粗壮,黄色
由表1-5可以看出,NAA浓度是影响红叶石楠生根的主要因素。
其中NAA0.1mg/L时根的长势最好,当NAA浓度为0.2mg/L,0.4mg/L时,1∕4MS、1∕2MS、MS培养基的生根率均较低,
此外,培养基中的无机盐浓度对红叶石楠生根也有一定影响。
综合生根率和生根条数及苗的生长情况,认为采用1∕2MS+NAA0.1mg/L培养基为宜。
3蓝花楹的组织培养
3.1材料和方法
3.1.1实验材料
试验材料取自江苏农林职业技术学院花房内,一年生实生苗的新生嫩稍。
3.1.2试验方法
3.1.2.1材料处理
晴天中午,采集蓝花楹当年生枝条的幼嫩茎尖,用洗衣粉浸泡5min左右再用自来水冲洗10min以备用。
不能浸泡或冲洗时间过长。
这样可清除许多杂菌,然后再进行更深层灭菌。
3.1.2.2启动培养
将冲洗干净的蓝花楹的嫩尖剪成1cm大小的茎尖或带一个单芽的茎段,剪去多余叶片,只留两边叶柄约2mm,用75%的酒精浸泡30s,再用0.1%升汞灭菌6分钟,倒去灭菌液,用无菌水冲洗3-4次,以最大限度地减少HgCl2残毒对外植体的影响。
灭菌完毕后,迅速将外植体基部插入培养基。
培养基分别采用MS和B5基本培养基,蔗糖30g/L,激素分别附加BA,NAA,2,4-D的不同组合。
组合方式见表:
表2-1蓝花楹启动培养激素L9(34)正交设计表
因素1(基本培养基)2(6-BA)3(2,4-D)4(NAA)
1MS0.500.1
21/2MS1.00.20.3
3…B52.00.50.5
3.1.2.3增殖培养
在无菌条件下待诱导出的不定芽长到2cm时剪下,将其分割成单芽,接入增殖培养基中。
增殖培养基分别为MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.3mg/L,MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L。
30天后统计增殖系数。
3.1.2.4生根培养
选择生长健壮的蓝花楹组培苗,将其转入生根培养基,生根培养基配方为:
1/2MS+NAA0.2mg/L,1/2MS+IBA0.2mg/L。
20天后统计生根率。
3.2结果分析
3.2.1启动培养
3.2.1.1不同培养基对蓝花楹的启动影响
表2-2不同培养基对蓝花楹的启动影响
培养基
处理号
6-BA(mg/l)
2,4-D(mg/l)
NAA
(mg/l)
接种数
成活数
成活率(%)
苗的长势
MS
1
0.5
0
0.3
5
4
80
叶片卷曲,叶色正常。
MS
2
1.0
0.2
0.1
4
3
75
叶片舒展,但叶色发黄。
MS
3
2.0
0.5
0.5
2
2
100
基部有愈伤,叶片长势正常。
1/2MS
4
0.5
0.2
0.1
8
6
75
叶片稍黄,甚有脱落,长势慢。
1/2MS
5
1.0
0.5
0.5
5
4
80
长势不佳且愈伤明显。
1/2MS
6
2.0
0
0.3
9
6
66.6
叶片卷曲,稍发黄,长势较慢。
B5
7
0.5
0
0.5
3
1
33.3
叶片卷曲,稍发黄,基部愈伤膨大。
B5
8
1.0
0.2
0.3
4
4
100
叶片舒展,生长健壮,但基部愈伤膨大。
B5
9
2.0
0.5
0.1
5
4
80
基部愈伤明显且发黄,叶片卷曲,有的脱落。
统计结果(表2-2)显示,2,4-D对叶片的舒展有很大的影响,不加2,4-D叶片卷曲。
不同培养基对蓝花楹的成活率和苗长势有一定的影响。
MS培养基叶片卷曲有愈伤且叶色发黄;1/2MS培养基叶片卷曲发黄甚有脱落有愈伤出现;B5生长健壮基部愈伤膨大,也有叶片卷曲发黄现象从表可以看出处理8效果最好,成活率达100%,苗的长势也非常好。
3.2.1.2不同培养基对增殖的影响
经过一个月的培养,统计蓝花楹的增殖分化情况得知,蓝花楹在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L的培养基上增殖情况较好,增殖系数达到5.4,且苗的长势好,叶片舒展,苗健壮。
3.2.1.3不同培养基对生根的影响
继代培养后的组培苗,转入生根培养基后,一周左右,基部便膨大,但是继续培养过程中,没有根长出,而且健壮的组培苗出现叶片萎蔫现象。
这可能是由于生根培养基不适合,或培养条件等其它方面的因素不适合造成的。
所以,蓝花楹组培苗的生根还需进一步试验。
4红花七叶树再生技术
4.1材料和方法
4.1.1材料
材料为红花七叶树当年生的嫩梢上的茎段,大叶柄,小叶柄和叶片为外植体。
4.1.2方法
于晴天中午采集外植体,用洗衣粉浸泡,流水冲洗。
于超净工作台上用用75%的酒精浸泡30s,再用0.1%升汞消毒,6-8分钟,并不断摇晃,然后用无菌水冲洗3-5次。
将外植体置于无菌滤纸上,将茎段切成1cm左右的单芽茎段,大叶柄和小叶柄切成1cm左右的小段,叶片切成5mm×5mm的小块,分别接种。
培养基分别采用MS和B5基本培养基,蔗糖30g/L,激素分别附加BA,NAA,2,4-D的不同组合。
组合方式见表:
表3-1红花七叶树启动培养激素L9(34)正交设计表
因素1(基本培养基)2(6-BA)3(2,4-D)4(NAA)
1MS0.500.1
21/2MS1.00.20.3
3B52.00.50.5
约20天后,愈伤组织变大,要将愈伤组织转入增殖培养基中,方法为将愈伤组织在无菌滤纸上切割成0.5cm3的小块,然后进行接种,增殖培养基为:
ⅠMS+BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+活性C0.2g/L;ⅡB+BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性C0.2g/L;ⅢB+BA2.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+NAA0.1mg/L+活性C0.2g/L,20天后,统计增殖情况。
4.2结果分析
4.2.1不同灭菌效果的试验
用不同的消毒时间对红花七叶树进行消毒,从表3-2可以得出消毒时间为8min时的成活率最高,成活率可达88.8%。
表3-2红花七叶树表面灭菌效果比较
灭菌时间(min)
接种数
污染数
死亡数
成活率(%)
6
19
4
0
78.9
7
24
3
0
87.5
8
18
1
1
88.8
4.2.2不同种类,不同浓度的激素对愈伤组织诱导的影响
外植体培养培养一周后,无论叶片还是叶柄普遍肿胀膨大,叶片以切口和叶脉处,叶柄以切口处为甚,继续培养,在叶脉和切口处,逐渐长出白色愈伤组织块,继续培养过程中,但不同种类,不同浓度的激素对愈伤组织的影响不同,发现1/2MS培养基培养只有膨大,而无愈伤长出,B5培养基都有愈伤长出,但继续培养时有褐化现象,而MS+6-BA0.5愈伤长势较好,愈伤组织由白色慢慢转绿,中间颜色最绿且成团状,所以MS+6-BA0.5mg/L为适宜的愈伤组织诱导培养基。
表3-3不同种类
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