MSP与BSP.docx
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MSP与BSP.docx
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MSP与BSP
BSP和MSP区别:
1)检测的内容不完全相同
BSP引物不包括CpG位点,在CpG位点的上下游,扩增后通过测序检测改位置的甲基化状态(测序如果CG不变则为甲基化,如果CG变为TG则为非甲基化)
MSP/USP是根据修饰后甲基化和非甲基化的引物不同扩增出不同的条带而判断是否为甲基化(只扩增出MSP条带表明为甲基化,如果扩增出USP则表明为非甲基化)
2)MSP原理:
甲基化特异性PCR(MSP)其原理为:
双链DNA变性解链后,在HSO3-作用下发生C→U转化,C若已有甲基化则无此改变;甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上,因此在HSO3-作用后,DNACpG岛若无甲基化,则序列中的改变为C→U,CG→UG,若有甲基化则为C→U,CG→CG,用不同的引物做PCR,即可检测出这种差异,从而确定基因有无CpG岛甲基化。
从理论上说,DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较,变化为C→T,CG→CG,相应其互补链的改变为G→A,CG→CG。
然后根据目的基因修饰前后的改变,相应设计M和U引物,有时我们需要设计两轮引物!
BSP法原理:
用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。
基因组DNA经亚硫酸盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T),最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。
3)一般用BSP找到甲基化位点,然后根据甲基化位点设计MSP引物,摸索条件以得到最优检测甲基化的方法。
BSP因为涉及测序,其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多等原因,操作繁琐,不易大批量操作。
MSP则可以检测大量标本并用于检测。
详细参见http:
//www.protocol-online.org/forums/topic/5371-differences-between-msp-and-bsp/
引物和探针你可以查文献看别人设计好的,然后再找公司合成,也可以自己设计
1、ABIMethylprimerExpressDNA甲基化引物设计软件使用
ABIMethylprimerExpressDNA甲基化引物设计软件使用-丁香园论坛=甲基化引物设计#14159723
2、甲基化的一些旧贴总结整理
较全的甲基化(MSP)原理及问题总结,希望对大家有帮助!
-丁香园论坛=荧光定量方法测甲基化#9184927
3、荧光探针设计软件操作说明
荧光探针设计软件操作说明-丁香园论坛=甲基化探针设计#6763407
DNA甲基化PCR引物的设计.pdf(931.16k) 在线查看
精品:
荧光定量PCR技术原理与结果分析..pdf(2157.35k) 在线查看
关于DNA甲基化引物设计除了常用的在线设计工具
MethPrimer:
http:
//www.urogene.org/methprimer/index1.html
BiSearchWebServer:
http:
//bisearch.enzim.hu/
ABI公司还给我们提供了另外一个选择:
MethylprimerExpress,并且这个工具还是免费的。
下载地址:
需要在网站上免费注册,才能下载。
软件的下载和安装,就不啰嗦了。
打开软件,主界面就是一个简单的框框,可以通过File→ImportSequence导入doc或者txt的序列文件,也可以用Edit→Paste或者直接Ctrl+V粘贴已经拷贝的序列。
这里以hMLH1基因为例,在UCSCGenomeBrowser中获得该基因CpG岛序列。
粘贴到上述对话框中,在SequenceFeatures菜单中,RenumberSequence对输入的序列进行重新排布,可以去除序列中的空白区域。
EnterSequenceName输入序列名称等信息。
点击DesignPrimers→FindCpGIslands。
弹出对话框
点击No,使用默认值进行搜索。
选择Yes,弹出CpGIslands选项,可对其进行自定义。
完成后,一路Next,默认是按预测出来的CpG岛设计。
在对话框中用橘黄色标识出来。
如果有特殊的要求,可以用鼠标选择感兴趣的区域,然后再Next。
在弹出的对话框中提供了简单的选择区域的信息,在对话框下方,选择你所需要的引物类型,包括MSP(methylation-specificPCR)和BSP(Bisulfitesequencing)。
以MSP为例,选择DesignMSPPrimers,单击Next。
同样,点击No,使用默认值进行搜索。
选择Yes,在MSPPrimers选项卡中,可对其进行自定义。
有人认为该软件得到的引物Tm值偏低,可以在此处将Tm值略微提高。
在该选项卡的下方,有一个搜索的选项,将滑块移向最右侧,速度最快,精确性最低;滑块在最左侧表示速度最慢,但精确性最高。
不同的选择得到的引物确实有比较大的差异。
反正我每次都让它慢慢来,不差那几分钟时间。
等计算机一阵狂算之后,得到了一系列引物(下图1处)。
越靠近横轴的,分值越高。
单击你需要的引物(反白显示),在下图2处会显示引物的详细信息。
也可以选择MSPPrimerReport(下图3处)获得详细的引物报告。
对于获得的引物,可以在methBLAST(http:
//medgen.ugent.be/methBLAST/)中验证其特异性如何。
也可以用Oligo6等软件来评价所设计引物的质量。
常见问题
MSP原理:
甲基化特异性PCR(MSP)其原理为:
双链DNA变性解链后,在HSO3-作用下发生C→U转化,C若已有甲基化则无此改变;甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上,因此在HSO3-作用后,DNACpG岛若无甲基化,则序列中的改变为C→U,CG→UG,若有甲基化则为C→U,CG→CG,用不同的引物做PCR,即可检测出这种差异,从而确定基因有无CpG岛甲基化。
从理论上说,DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较,变化为C→T,CG→CG,相应其互补链的改变为G→A,CG→CG。
然后根据目的基因修饰前后的改变,相应设计M和U引物,有时我们需要设计两轮引物!
试验中的对照体系能保证MSP反应体系可靠性,MSP阳性对照选取的方法有以下几种:
(1)查文献找目的序列MSP阳性的细胞,用其修饰后DNA做阳性对照。
(2)购买商品化的MSP阳性对照,但较昂贵。
(3)自制MSP阳性对照:
用CpG甲基化酶(M.SssI)处理胎盘DNA做阳性对照。
因为CpG甲基化酶M.SssI能识别并甲基化CpG识中所有C,使其与MSP方法所理想的DNA状态一致,可模拟生物基因组的修饰模式,故可用来做阳性对照。
方法如下:
先用CpG甲基化酶(NEB公司)在37℃下处理胎盘组织DNA1h,再经亚硫酸氢钠修饰后,即可做阳性对照用于优化MSP的反应。
(甲基化方法步骤)
(石蜡组织DNA甲基化检测)
(阳性对照)
(修饰过程中是否糖原可以不用)
(第二轮模板稀释)
(试剂的配置)
(试剂的处理)
(手工修饰和试剂盒修饰的差异)
常见问题
MSP结果分析-丁香园论坛
(MSP产物弥散)
MSP结果不稳定,重复性很差
(本人做的总结)
(个人觉得很好,对重复性差的解释)
(血清DNA提取MSP的讨论,个人觉得不错)
(甲基化模板的提取)
(Chemicon公司的CpGenome甲基化试剂盒做MSP的问题)
回复:
【求助】dNTPs与dNTP的区别-丁香园论坛 (甲基化中dNTPs与dNTP的使用注意区别)
(甲基化中SssI酶哪里买)
(甲基化与部分甲基化的区别)
(DNA甲基化攻略)
MSP引物相关问题
(引物探讨)
(肿瘤基因甲基化引物总结)
05920_1.html (甲基化中W,U,M三对引物问题)
(引物设计)
(引物设计)
(甲基化荧光定量PCR引物问题)
(引物设计网站)
甲基化检测时MSP引物设计原则及相关问题-丁香园论坛 (引物设计原则及相关问题)
回复:
【分享】甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)-丁香园论坛 (精华贴)
案例分析1:
✧我最近在做的课题涉及到基因甲基化的检测,用到了MSP方法。
但是目前初步试验了几次结果不是很理想。
现在我先提取的正常人外周血淋巴细胞DNA,然后做亚硫酸氢钠修饰,提纯之后跑PCR,没有成功。
我想可能在修饰这一步不是很成功。
想请教一下,修饰过程中有哪些需要注意的。
比如各个试剂需要什么样的要求,pH调节需要精确到什么程度,反应温度和时间需要注意哪些问题,提纯和冷乙醇沉淀有什么注意点。
这里附上我的protocol,望指点。
不胜感激!
1.约1μgDNA溶于45μL灭菌去离子水,加入3mol/LNaOH溶液5μL,混匀,37℃水浴孵育20min。
2.加入新鲜配置的10mmol/L、pH5.0对苯二酚30μL和3mol/L、pH5.0NaHSO3520μL,混匀,100μL石蜡油覆盖,55℃水浴避光孵育16hr。
3.按照WizardDNAClean-UpSystem试剂盒protocol纯化DNA,溶于45μL灭菌去离子水。
4.加入3mol/LNaOH溶液5μL,混匀,37℃水浴孵育20min。
5.加入5μL3mol/LNaAc(4℃、pH5.2),冷乙醇(-20℃、100%)100μL,混匀,-20℃过夜。
6.20000g、4℃离心30min,弃上清,加入70%冷乙醇(-20℃)200μL,20000g、4℃离心10min,吸去上清,并重复一次,注意将溶液充分吸干。
7.所得DNA沉淀充分吹干,溶于40μL灭菌去离子水,直接行PCR。
✧你好.我也在作MSP,客观说这种方法比较难作.我现在也没有作成功,不过我们可以互相交流共同进步嘛.我看了你的操作过程,首先感觉在加3mol/LNaOH后进行变性的温度可以适当提高,我看过国外的文献,建议作42℃水浴孵育20min.因为这一步如果不能完全将双链变成单链,下一步的修饰就很困难.你可以试一下.其次,我看了其他人的帖子才知道,经过NaOH处理后的DNA很脆,所以混匀动作一定要轻柔,不能将DNA链弄断,如果链断裂也是P不出来的.最后我也有问题要请教你:
1我是用2微克DNA来进行处理的,这样的好处是虽然回收率不一定高可是得到的DNA还是可以满足PCR对模板量的需求,同时我想知道和你的1微克相比我的DNA较多是否导致处理不完全?
2我的对苯二酚没有调PH值,不知你是用什么来调节其PH值的?
3纯化回收后再加NaOH37℃水浴孵育20min的目的是什么?
4提取DNA时对冰乙醇的温度有要求吗?
我都是在4℃冰箱保存的.
5你的PCR扩增用哪个公司的引物?
是普通合成还是特殊要求的?
对了,你的操作过程中没有加糖原来促进DNA沉淀,我是用10mg/ml的,加入量为1ul.然后-20℃过夜。
我的邮箱:
**********************.cn愿意的话可以发邮件交流。
祝我们大家实验顺利!
✧琼脂糖包埋可以减少DNA的降解和丢失,而且操作简单。
✧你好,我之前一直在做MSP的实验。
有时实验效果会差点,但是没试过做不出来。
我自己的经验是:
1。
NaHSO3的pH必须严格调到5.0。
我们实验室是用pH计测的,应该算是比较准的。
pH对实验结果的影响比较大。
2。
DNA变性要彻底。
我在NaOH处理之前,用枪头对样品反复吹打,并用沸水煮2min,然后NaOH42℃40min。
一般来说,我是不会去避免DNA断裂的,私下以为一定程度的断裂反而有利于变性完全。
很多文献在DNA变性处理这一步前也是先用酶切处理的。
3。
bisulfite处理一步,先加hydroquinone再加NaHSO3。
为了避免反应过度造成假阳性以及DNA断裂,我是用50℃处理。
试过14~16h都ok。
4。
DNA乙醇沉淀一步我是-20℃过夜沉淀的,没有另外加助沉剂,用14000rpm收集沉淀。
最后用TE溶解。
5。
很多时候,MSP不成功是由于PCR失败。
设计一对适合工作的MSP引物并不容易。
我们实验室有时对一个基因要设计3、4对引物才能得到比较好的实验结果。
所以验证自己的MSP是否成功,有一对肯定可以工作的引物是最重要的。
同时设置一个阴性对照,就是用根据未修饰序列设计的引物做PCR,一般情况下也可以扩出东西,起码说明回收的东西里面有可以进行PCR的DNA,以及可以看出bisulfite处理的效果。
✧最近按照fallinqlove战友的指导,实验终于有了进展。
就上面大家提到的问题,说说自己的体会吧。
1.修饰前DNA是否需要打断。
我曾经问过国外一个实验室的老板,他说无须事先酶切,~2微克的DNA/50微升体系,修饰16小时是可以的。
当然,理论上先酶切或是反复抽吸打断DNA似乎有利于修饰完全。
2.修饰前NaOH的处理其实37度15分钟就已经够了。
文献报道这一步所用的温度和时间版本较多,但是37度15分钟似乎是底线,实际上也够了。
有人高温再迅速冰却,理论上更好啦,因为目的只是解链。
3.pH的问题。
跟战友讨论过,对苯二酚和醋酸铵无须调节pH了,亚硫酸氢钠还是要调节到5.0的。
以前我用精密试纸,现在用电子pH计,事实上两者似乎差异较大。
前者主观判断上可能有差异,后者就是标准液要小心。
总之pH调节准确很关键。
4.反应时间。
我现在用的55度16小时,修饰是可以成功的。
请教过别人,一个经验较为丰富的博士后说,55度12小时以上就可以了。
其实文献报道的版本也不尽一致,个人认为温度50-55,时间12-16也许都是可行的。
时间过短修饰可能不完全(尤其是DNA量~2微克/50微升体系的时候),过长的话甲基化的C也可能开始变了。
5.修饰提纯之后加NaOH貌似是脱硫用的,然后冷乙醇沉淀。
我现在用-70度3小时,个人认为足够了。
而且这样做省时一些。
-20度过夜也是可以的。
6.至于糖原,我没有加。
有战友认为这个很重要,也有实验成功的战友说其实根本不需要加。
在坛子上见到过一个回复,说糖原其实并不能促进沉淀,只是相当于一种指示剂,在DNA量小的情况下冷乙醇沉淀之后不易见到,加了糖原之后可见沉淀,这样吸取上清的时候就不会把微量的DNA给扔掉。
7.PCR我使用了hotstart酶,特异性好一些。
国外那个教授告诉我他们只是用munual的hotstart,也可以。
这一点战友们讨论也较多,经验不一。
有人说普通酶普通PCR效果也可以,有人则说必须金牌酶热启动。
我觉得跟大家所扩增的片断也是有很大关系的,究竟用什么方式的PCR和相应的酶,还得自己摸索看看。
我现在用的TaKaRa的hotstart酶,感觉还行,而且也不贵。
引物我是上海申能博彩合成的。
8.所用的普通试剂都是4度保存的,对苯二酚和亚硫酸氢钠现配现用。
整个操作过程尽量避免所有不必要的振荡,减少单链DNA的损失。
下一步我要挑战更难的。
提取血清DNA做MSP。
有经验的战友出个面啊,呵呵。
回收率我没有计算过,总是觉得整个实验中DNA太宝贵了,修饰提纯之后是不跑胶的,冷乙醇沉淀之后也不测OD值。
1微克DNA做到最后溶解在40微升水里面,PCR体系25微升,其中DNA加5微升,目标条带是比较清晰的。
事实上提纯之后没有加NaOH和冷乙醇处理之前跑胶并不需要。
战友说过,此时DNA是单链状态。
二聚体似乎不可避免,并且后面也会有浅浅的拖带,但是都比较淡。
有拖带是说明不了有目标条带的,一定要有marker标记,找到你的目标条带才行。
案例分析2:
我是刚做msp的新手,按照手工修饰dna的方案,处理dna后,进行pcr扩增,全是弥散从未有条带,像是dna降解的样子,在两条染料之间是一片红色,退火温度一直在调整,所有的pcr成分也是在调整连非特异条带都没有。
真不知是啥原因?
用内参扩增却有条带,但是也是有弥散的一片在一块,只是夹有目的基因,真不知是啥原因这一片红色的东西。
✧我也碰到过弥散,不过调整温度,引物浓度,增加DMSO之后就出现带了,你可以试试加点佐剂看看
DMSO的用量各反应体系不同,我常用5%的。
DMSO通常经验性地用于提高PCR扩增的效率,但是过量的DMSO可以显著降低特异序列的扩增效率,尤其是导致非特异性扩增。
DMSO作用机制是由于这些有机溶剂在DNA的水溶液中通过脱水(dehydrution)作用导致DNA结构的不稳定性,从而功能性的降低G+C富集区的熔点及解链温度提高了扩增效率。
每10%的二甲基亚 降低熔点及解链温度5.5~6℃。
某些实验中在6%的DMSO存在时,开始出现非特异条带,同时特异扩增产物减少。
可通过增加模板-引物的比例消除非特异条带。
而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物,不能避免非特异扩增。
对于DMSO浓度过高时又同时使Taq酶变性失活降低扩增效率.可增加Taq酶用量来消除.
再加一个:
甜菜碱(Betain)化学名为甘氨酸三甲内盐,它有两大优点,
(1)可增加Taq酶的稳定性,防止其因温度升高而变性;
(2)降低双螺旋DNA的稳定性,使二级结构易打开,从而促进高GC含量基因的扩增。
而且只有甜菜碱的浓度达到一定值时才能发挥作用[9,10,11]。
有报道是终浓度1.11~2.15M。
有机溶剂对Taq聚合酶活力的影响
物质 浓度 活力(%)
乙醇 <3% 100
10% 110
尿素 <0.5mol/L 100
1.0mol/L 118
1.5mol/L 107
DMSO <1% 100
10% 53
20% 11
二甲基甲酰胺 <5% 100
10% 82
20% 17
甲酰胺 <10% 100
15% 86
20% 39
SDS 0.001% 105
0.01% 10
0.1% <0.1%
✧我用降落加巢式PCR的方法扩增MSP,有弥散带及非特异性条带,但目的条带清晰可见,我想如果降落加巢式PCR,再用上DMSO,可能效果会不错。
✧我觉得MSP最重要的是模本和引物,PCR条件虽然重要但不是最关键的,如果模本和引物没问题那你这么长时间至少也应该做出来点模糊的目的带了。
我做MSP时体系和循环条件都和普通PCR一样,也没加“佐料”或用巢式,效果也还行。
建议你先换个经典的(文献重复较多的)引物做一下。
如果你用的是石蜡标本,那最好先换新鲜组织做一做,石蜡太不好做了。
✧最近这段日子一直在做MSP,又得到了一些经验.结论和上面有一位说得相似,引物是最重要的
最近对之前难扩的引物重新设计了一下,结果效果好很多,有些位点先前的引物很难出来,又加这个又加那个的才有弱弱的条带,而且效果不稳定.用新的位点一下子就出来了,而且温度范围很宽,特异度也高.
之前用DMSO是考虑到GC含量高(有70%),将其拉下来,并且用特异性产物优势扩增去抑制其他的,但换引物以后普通的体系也出来了.
另外添加剂的使用效果在原先就有目的条带但不是很特异或者比较弱的情况下使用效果比较好,完全没有产物时比较渺茫.
所以建议xdjms可以考虑更换引物
还有就是模板的质量也很重要,在同样的引物和条件下,用我师兄修饰的模板结果明显比我好太多,我俩唯一的区别就在于他是用Qiagen的试剂盒提得DNA而我用的是国产的.
至于修饰过程我的结论是怎么折腾都没大问题.我和同伴曾经进口和国产的试剂都用过,试剂没有用新配的,算错过亚硫酸氢钠的量,忘记和加多了氢鲲,忘了加石蜡油,孵育时用了温度差好大的坏水浴锅,忘记倒滤过液就洗脱等等,总之什么错误都犯了
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