庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系Word文档格式.docx
- 文档编号:986773
- 上传时间:2023-04-29
- 格式:DOCX
- 页数:6
- 大小:19.48KB
庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系Word文档格式.docx
《庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系Word文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系Word文档格式.docx(6页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
【关键词】耳毒性庆大霉素热休克蛋白耳蜗免疫组化
AbstractObjective:
Tostudytherelationshipofexpressionofheatshockprotein70(HSP70)instriavascularisandABRongentamicin(GM)ototoxicityinducedindifferenttimeofguineapigscochlea.Methods:
Atotalof100healthywhiteguineapigswithredeyeswerestudied.Theywereall200~250gweightanddividedintotwogroups,GMandsalinecontrol.Eachgroupweremedicatedcontinuitlyfor10auditorybrainstemresponse(ABR)thresholdonthe1st,3rd,7th,14th,30thdaybeforeadministrationandafterdiscontinuationwerestainingwasusedtoobserveGMototoxicityinducedexpressionofHSP70.Results:
TheexpressionofpositiveproductionofHSP70instriavascularisofcochleareachedthemaximumonthe3rddayafterdiscontinuationinGMgroup,aswellasthethresholdofABR.ThestainingtrunedtolightgraduallyandthethresholdofABRdegradedgraduallyaccompaniedwithextensionoftimeofdiscontinuation.Thestainingapproachednormollevelonthe30thdayafterdiscontinuation,butthethresholdofABRwasstillhigherthannormollevel,andtherewassignificancecomparedwiththecontrolgroup(P﹤.Conclusion:
TherewasalinearcorrelationbetweentheaveragegrayofHSP70instriavascularisandtheABRthresholds.HSPisalsotheindexofcellresumingafterstressstimuli.
Key wordsdrugtoxity;
gentamicins;
heatshockprotein;
striavascularis;
immunohistochemistry
庆大霉素(gentamicin,GM)耳中毒后能够诱发耳蜗热休克反映,增加热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70在豚鼠耳蜗的表达,且ABR阈值转变与HSP70表达的转变高度负相关,HSP70具有爱惜听力的作用[1]。
用扫描电镜(scanningelectronmicroscopy,SEM)的方式结合听脑干反映(auditorybrainstemresponse,ABR)阈值的检测已经证明:
GM耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞损伤后存活30d者其耳蜗毛细胞形态上有所恢复,且ABR阈值也有必然程度的恢复,GM耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞具有再生修复能力[2]。
那么,HSP70在GM耳中毒后不同时刻是不是也表达并具有爱惜听力的作用呢?
HSP70的表达与ABR的关系如何呢?
目前尚不清楚。
本实验应用SABC免疫组化技术及图像分析技术并结合ABR测试,观看GM耳中毒不同时刻豚鼠耳蜗HSP70表达及HSP70表达与ABR的关系,进一步探讨HSP70表达与GM耳中毒毛细胞再生修复的关系及作用机制。
1材料与方式
实验动物分组及耳毒模型的复制耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠100只(沈阳医学院动物室提供),体重200~250g,雌雄不拘,随机分成正常对照组、GM组,每组50只。
正常对照组:
每日腹腔注射GM等量的生理盐水kg(河南三九益民制药生产,批号:
0501);
GM组:
每日腹腔注射硫酸GM注射液100mg/kg(沈阳第一制药厂生产,批号:
0308021)。
各组皆持续用药10d。
ABR阈值检测在用药前和停药后第一、3、7、14、30天,用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉,利用Danac7型声刺激器(日本ダナジャパン株式会社)发出主频率为2kHz的滤波click声刺激信号,滤波带宽50~3000Hz,距离时刻90ms,扫描时刻20ms,耳机距豚鼠外耳道约左右。
记录电极置颅顶正中,参考电极及接地电极别离置于给声耳及对侧耳后乳突部皮下,以DAT100型叠加仪(日本光电株式会社)进行叠加200次,以VC10示波器(日本光电株式会社)输出信号,观看时程为20ms,测试强度由95dBnHL开始,按10dB递减,接近阈值后按5dB逐档递减,听阈判定以刚显现ABR的P3波为准。
耳蜗冰冻切片的制备各组豚鼠在行第二次ABR检测后,将豚鼠快速断头,迅速掏出听泡。
打开听泡后,充分暴露耳蜗,在解剖显微镜下刺破圆窗膜,将镫骨底脱位暴露卵圆窗,在蜗顶钻一小孔,用微量注射器缓慢注入含40g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液,再将标本置于上述固定液中4℃下2h。
磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution,PBS)冲洗后,放入100g/LEDTA中4℃下脱钙5~7d,再移入250g/L蔗糖磷酸缓冲液中,4℃留宿。
第二天用OCT包埋,行20μm恒冷冰冻切片。
免疫组织化学方式检测HSP70HSP70免疫组织化学方式检测试剂盒由武汉博士德生物工程提供。
切片干燥后,用蒸馏水洗3次。
将切片放入用甲醇稀释的5g/LH2O2中室温下浸泡30min,以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次。
滴加抗原修复液,室温10min,蒸馏水洗3次。
滴加正常血清封锁液,室温下孵育20min,甩去多余的液体,然后滴加稀释度为1:
150的一抗,4℃留宿。
用L的PBS(pH=)洗3次。
滴加二抗,室温孵育20min,用L的PBS洗3次。
滴加SABC溶液,室温孵育20min,L的PBS漂洗4次,DAB显色,脱水,透明,封片。
显微镜下观看。
阴性对照组,用L的PBS代替一抗,其他程序不变。
显微图像分析处置采纳MetaMorph/Coolsnapfx/AX70显微图像分析系统(美国、日本联合生产),每组随机抽取20张切片,将载玻片置于显微镜(10×
40)下,呈现图像后,用数码照相机拍照后,将图像输入运算机,在一样条件下测量各组每张切片血管纹细胞HSP70阳性反映产物灰度值,别离计算各组血管纹细胞HSP70阳性反映产物平均灰度值。
统计分析将实验数据进行处置,数据以均值±
标准差(x±
s)表示,显著性查验采纳t查验及相关分析。
2结果
ABR阈值检测各组ABR结果如表1所示。
各组用药前ABR阈值不同无显著意义(P﹥)。
停药1d后,GM组的ABR阈值明显高于正常对照组(P﹤);
停药3d时,GM组的ABR阈值最高,以后随着停药时刻延长ABR阈值慢慢降低,但仍明显高于正常对照组(P﹤)。
表1各组豚鼠用药前后的ABR阈值注:
与用药前比较:
1)P﹤;
与正常对照组比较:
2)P﹤HSP70免疫组织化学方式检测结果
光镜观看结果豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物呈棕黄色颗粒。
正常对照组细胞:
各时刻组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物均呈弱阳性;
GM组的豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物明显强于正常对照组,随着时刻延长染色慢慢减弱,停药30d时染色接近于正常(如图1~3所示)。
图像分析各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值结果如表2所示。
GM组中停药后不同时刻豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物的平均灰度值均较正常对照组明显减少(P﹤),即GM能显著增强耳蜗HSP70的表达。
在各时刻组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值,停药3d组其HSP70阳性反映的平均灰度值最低。
停药30d时染色接近于正常,较正常对照组相较不同无显著意义(P>)。
表2各组豚鼠耳蜗各部份HSP70阳性反映的平均灰度值比较:
1)P﹤;
2)P﹤
豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值与ABR阈值的关系停药后不同时刻,随着各组豚鼠耳蜗HSP70阳性反映的平均灰度值的转变,ABR阈值也发生相应的转变,耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值越高,ABR阈值越低,它们之间呈负相关(表3)。
即HSP70表达越少,ABR阈值越低。
表3豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反映平均灰度值与ABR阈值的相关分析注:
相关系数的假设查验:
1)P﹤
3讨论
实验结果说明,在各时刻组豚鼠耳蜗ABR阈值检测中,停药3d时,GM组的ABR阈值最高;
在各时刻组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值,停药3d组其阳性反映的平均灰度值最低。
这意味着GM耳中毒后,以停药3d组受损最重,且HSP70的表达和生理功能具有一致的表现。
HSP70的细胞爱惜作用是指在受到各类应激刺激时,产生HSP70能够增强细胞对损害的耐受程度,维持细胞的正常功能代谢,提高细胞生存率[3]。
在应激状态下,HSP70的表达及细胞爱惜作用与细胞的生理状态有关。
Gutsmann等证明,随着机体衰老和细胞老化,HSP70和HSP70mRNA的功能和合成均有所降低,因此HSP表达的改变不仅可能是机体衰老和细胞老化的一个重要因素,而且还能够作为判定细胞生理状态和应激能力的一个标准[4]。
实验结果说明,在GM耳中毒后HSP70表达增强,说明GM耳中毒耳蜗细胞生理功能状态良好。
实验结果还证明,随着GM耳中毒后停药时刻的延长,各组豚鼠耳蜗ABR阈值降低,且各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物减少、灰度值增加,HSP70阳性反映产物灰度值与ABR之间呈负相关。
咱们前期工作已经证明在停药30d时,GM耳中毒耳蜗毛细胞在形态和功能上都可有必然程度的恢复。
因此咱们以为,HSP还能够作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。
目前,大多数学者以为HSP在应激情形下表达具有使听觉细胞免受进一步损害,具有爱惜听力的作用[5]。
HSP的细胞爱惜作用与由于感染、中毒、缺血、缺氧引发毛细胞损伤,常伴有大量OH-·
、O-·
2和H2O2的产生,促使细胞内“Ca2+超载”,和细胞内蛋白质构型改变和功能障碍,由此引发细胞的应激反映。
HSP通过反馈作用减少自由基的产生以爱惜细胞免受进一步损害有关。
Na+/K+ATP酶是所有高等动物的大多数细胞膜的一个组成部份[6],也是内耳能量代谢和离子转运的关键酶之一,它是耳蜗代谢改变和初期病理转变的基础[7]。
有文献报导AmAn耳毒性与耳蜗Na+/K+ATP酶活性降低有关[8]。
HSP可使严峻受损而难以恢复的蛋白迅速降低,恢复细胞膜上Na+/K+ATP酶活性[9]。
在GM各时刻组中,随着停药时刻的延长,豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反映产物慢慢减少,且ABR阈值有所恢复,在停药30d时豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反映产物的灰度值和ABR阈值接近正常对照组。
推测HSP70在GM耳中毒耳蜗毛细胞再生修复中可能与通过恢复细胞膜上Na+/K+ATP酶活性,来降低GM的耳毒性,使耳蜗细胞恢复正常生理功能,增进耳蜗毛细胞的再生和修复有关。
【参考文献】
[1]倪月秋,汤浩,符文双,等.豚鼠庆大霉素耳中毒后诱发的耳蜗热休克反映[J].中国应用生理学杂志,2002,18
(2):
179-182.
[2]NiYueqiu,TangHao,Cuiofcochlearhaircellsofguineapigsfollowinggentamicinototoxicity[J].ZhongguoLinchuangKangfu,2006,10(30):
177-179.
[3]郑磊,颜晓慧.热应激时热休克蛋白70及其细胞爱惜作用[J].国外医学卫生学分册,1999,26(4):
209-212.
[4]GustmannCA,HeydariAR,YouS,etal.Theexpressionofheatshockprotein70decreaseswithcellularsenescenceinvitroandincellsderivedfromyoungandoldhumansubjects[J].ExpCellRes,1998,241
(2):
404-413.
[5]LimHH,JenkinsOH,MyersMW,etal.DetectionofHSP72synthesisafteracousticoverstimulationinratcochlea[J].HearRes,1993,69:
146-150.
[6]SchulteBA,AdamsJC.DistributionofimmunoreactiveNa+,K+ATPaseingerbilcochlea[J].JHistochemCytochem,1989,37:
127-134
[7]楮汉启,熊浩,韩芳,等.离子转运蛋白抑制-听觉实验研究NKCCl和Na+,K+ATPase在耳蜗K+循环中的作用[J].华中科技大学学报(医学版),2006,35(5):
630-632;
637.
[8]李朝军,刘兆华,王锦玲.内耳Na+/K+ATP酶的研究进展[J].国外医学耳鼻咽喉科学分册,1993,17(6):
321-325.
[9]许川山,吴士明.热休克蛋白表达与脑缺血损害[J].现代康复,2000,4(11):
1694-1695
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 庆大霉素 中毒 不同 时刻 耳蜗 血管 HSP70 表达 ABR 关系