LH20装填和使用说明.docx
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LH20装填和使用说明
SephadexLH-20装填指南
SephadexLH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化工而成,属于分子筛凝胶,尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。
例如:
类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等,SephadexLH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备,即可用于初步纯化步骤,也可用与最终精制步骤,如非对映同分异构体的分离。
制备凝胶悬浮液
装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。
胶颗粒越均一(粒径分布越窄),越容易获得稳定均一的柱床。
但是对于SephadexLH-20而言,25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言,不能说分布均一,也就是说其粒径分布较宽。
然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。
这对于长柱(最高至250cm)而言也是同样的。
在装柱前,层析柱和储槽都必须进行彻底清洗。
SephadexLH-20在使用之前必须进行溶胀。
在溶胀的过程中,要尽量避免过分搅拌,否则会破坏球形胶粒,且要避免使用磁力搅拌器。
1.在室温下,将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时,溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统,请参考后页之胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。
2.使溶胀的胶体积沉淀之后占总体积的75%,上层溶剂占25%,这时,悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒可移动。
3.将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内,在保证胶粒不变形的前提下,应在尽可能高的压力下装柱,反压不要超过1.5ba。
表一干胶溶胀表
溶剂
床体积(mL凝胶/g干胶粉末)
Dinethylsulphoxide二甲亚砜
4.4~4.6
Pyridine嘧啶
4.2~4.4
Water水
4.0~4.4
Dimethylformamide二甲基甲酰胺
3.8~4.2
Saline生理盐水
3.9~4.1
Methanol甲醇
3.8~4.1
Methanedichloride二氯乙烷
3.8~4.1
Chloroform1氯仿
3.8~4.1
Propanol丙醇
3.7~4.0
Ethanol2乙醇
3.6~3.9
Isobutanol异丁醇
3.6~3.9
Formamide甲酰胺
3.6~3.9
Methylenedichloride二氯甲烷
3.6~3.9
Butanol丁醇
3.5~3.8
Isopropanol异丙醇
3.3~3.6
Tetrahydrofuran四氢呋喃
3.3~3.6
Dioxane二氧杂环乙烷
3.2~3.5
Acetone丙酮
2.4~2.6
Acetonitrile3乙腈
2.2~2.4
Carbontetrachloride四氯化碳
1.8~2.2
Benzene苯
1.6~2.0
Ethylacetate乙酸乙酯
1.6~1.8
Toluene甲苯
1.5~1.6
1.包含1%的乙醇。
2.包含1%的苯。
3.溶胀胶体积小于2.5mL/g的溶剂没有使用价值。
平衡
上样前,用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止,如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质,并根据性质确定柱高调节器的位置,如使用相同的溶剂,在以后的层析中柱平衡可以省略。
洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命,所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。
样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%,同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。
洗脱
洗脱流速应根据情况而定,最大线流速约12cm/min(反压1.5ba),建议流速为1-10cm/h。
总体来说,较低的流速,具有较高的分辨率。
再生
凝胶再生通常事先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗,如果换洗脱液,则需要重新平衡。
体积流速与线性流速的关系
线性流速=体积流速/横截面积
溶胀体积
由于SephadexLH-20的溶胀体积依赖于溶剂,所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。
新体积=旧体积×(新柱体积/旧柱体积)
胶的性质
SephadexLH-20同时具备亲水和亲脂双重性质,且被分离物质的极性再分离过程中起着重要作用。
排阻极限
4-5KD(与所有溶剂有关)
上样量
吸附模式
取决于所需分辨率
分子量大小
小于总体积的20%
正相分配
小于总体积的1%
胶粒形状
球形,多孔
颗粒大小(干)
18-111um(直径)
颗粒大小中间值(干)
70um(直径)
颗粒大小(甲醇)
27-163um(直径)
颗粒大小中间值(甲醇)
103um(直径)
最大线性流速
720cm/min
参考线性流速
60cm/min
pH的稳定性
操作中
2-11
清洗中
2-13
化学稳定性
在许多水溶液及有机溶剂系统中都定。
在pH2以下或强氧化剂中不稳定
高压灭菌
121℃可忍受20分钟
操作温度
4℃到40℃
保存条件
新填料
4-25℃(干燥)
使用后填料
4-8℃,pH6-8,切勿冷冻,加入抑菌剂(如20%乙醇,0.04%叠氮钠)
葡聚糖凝胶SephadexLH-20使用说明
1450.00/100g
产品
LH-20
分离范围(球蛋白)
100-4000
颗粒大小(μm)
20-150
特性/应用
胆固醇,脂肪酸,激素,维他命,天然产物
PH稳定性
2-13
最高流速(cm/h)
400
适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子,天然产物在有机溶剂中的纯化。
可以非常经济的大规模制备各种天然产物,尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。
结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身,能分离结构相近的分子。
因此使用中要考略几种色谱的作用机制。
最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当,分离效果可保持不变。
上样量视被分离物的结构性能的差异而定-差异大,则大;差异小,则小。
凝胶过滤的上样量一般为5-7%的床体积,我们建议初次上样量控制在1-2%的床体积,视分离情况可以逐步增加;柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制;流动相可参考TLC的条件,正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。
流动相的常用溶剂为:
水甲醇丙酮乙酸乙酯二氯甲烷
上述溶剂的极性依次降低,对带有极性的被分离物而言,保留值和分离度依次递增;同理选用的凝胶柱高可依次降低,流速可以增大(或上样量可以增加,树脂体积在低极性溶剂中明显收缩)。
溶剂的溶解性,极性,沸点,毒性都是要考虑到的,二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。
甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离采用,葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。
LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质,且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。
使用方法:
将干粉浸泡于60—70%乙醇中过夜(充分搅拌),洗去可能存在的残留物,抽干然后湿态不间隙装柱,绝对不能出现凝胶断层(否则要重新装柱),动态用一倍柱体积的60—70%乙醇淋洗,再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止,如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质,并根据性质确定柱高.如使用相同的溶剂,在以后的层析中柱平衡可以省略。
1.先讲SephadexLH-20的原理。
SephadexLH-20的分离原理主要有两方面:
以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。
因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱,SephadexLH-20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
2.再讲SephadexLH-20洗脱溶剂。
SephadexLH-20洗脱溶剂分为两类:
反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统最为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
正相系统以氯仿--甲醇最为常见,先用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
3.接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大,选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(必须要进行过滤!
否则把SephadexLH-20堵塞,就必须将SephadexLH-20的柱头部分弃去,造成不必要的浪费)。
如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用最少体积的氯仿--甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
SephadexLH20使用心得谈:
1SephadexLH20是一种价钱较高的填料,使用请千万注意,很贵的哟!
(当然,老板有钱就另当别论拉)
2先讲SephadexLH20的原理。
SephadexLH20的分离原理主要有两方面:
以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。
因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱,SephadexLH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3再讲SephadexLH20洗脱溶剂。
听我讲完第2点后,其实就应该清楚SephadexLH20洗脱溶剂因分为两类:
反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统最为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
正相系统以氯仿--甲醇最为常见,先用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
4接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一定要滤喔!
要是把SephadexLH20堵啦,就得将SephadexLH20的柱头部分弃去,很心痛呀)。
如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用最少体积的氯仿--甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
5分离的技巧,最后说说我的使用心得
(1)流速不可太快,切切不可新急,所谓欲速则不达。
(2)柱子尽可能长,SephadexLH20柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。
所谓集中优势兵力,打击敌人。
(3)馏分一定要接的细,可1/10,或1/20个保留体积接成一馏分。
(4)洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用SephadexLH20分鞣质
(6)SephadexLH20对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。
(7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用
SephadexLH-20分离黄酮类化合物经验
人们对SephadexLH20的分离原理目前还主要认为有以下有两方面:
一)过滤作用,二)反相分配的作用(在反相溶剂中)。
因为凝胶过滤作用是反向分子筛原理,大分子的化合物被筛出,先被洗脱下来,小分子的化合物保留,最后出柱。
在反相溶剂洗脱,SephadexLH20对化合物还能起一个反相分配的作用,这个时候分子大小相同的化合物,极性大的那个就要被先被洗脱下来,极性小的化合物后出柱。
在正相溶剂洗脱,这主要*分子筛作用来分离。
SephadexLH20在黄酮类化合物分离纯化时比较有意思,对于分离黄酮苷元类化合物,主要起作用的是吸附作用,吸附程度取决于游离酚羟基的数目,但是成苷时,分子筛就起主导作用了。
在硅胶板上或聚酰胺薄层上与相对应的单个黄酮苷元几乎分不开,但是用小量氯仿比上大量甲醇混合溶剂溶解成真溶液后,上SephadexLH20,用甲醇冲洗,很快单个的黄酮苷元就下来了,双黄酮苷元要冲洗17~19个柱床体积才能下来,有黄色色带,肉眼很容易观察到。
关于SephadexLH20的梯度洗脱,大家意见也不同,这个只能自己对于自己所要分的那系列化合物试着做了,例如我在分离黄酮类化合物时基本上都是纯的甲醇,如果不行才会选用甲醇-水系统,例如好多人喜欢在反相溶剂洗脱中用的是甲醇-水系统。
先用水,然后增加甲醇比例,最后用甲醇冲柱;正相以氯仿-甲醇最为常见,起步比例氯仿-甲醇(1:
1),然后增加甲醇比例,最后用甲醇冲柱。
其实,在SephadexLH20使用过程中,分离技巧也是十分重要的,
1)流速要控制好,既不可过快也不可过慢,为了快加压,分子筛效果就会大大降低;过慢会导致样品在柱子扩散严重,达不到分离效果。
2)柱子要长短适应(决不象有些人说的那样,越长越好,我们就两个SephadexLH20上行为相似的黄酮苷元做过试验,相同的胶体装一根又细又长和长短合适的柱子,前者分离效果反而不好,觉得可是能流速会降低,相应的扩散也变大了)。
3)每一流分一定要细接,千万不要怕麻烦,我们常1/15~1/30个保留体积一接。
再提两点注意事项:
1)如果黄酮类化合物粗提物中有鞣质,那么你就要小心了,SephadexLH20对鞣质几乎是死吸附的。
为了给老板省钱,最好先考虑除鞣,再用SephadexLH20。
2)上样量不要超载,使用这么长时间的SephadexLH20了,不同种类的化合物会不同,但是整体上载样量不大,千万注意不要超载。
生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。
纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性,然后通过实验选择出最有效的纯化流程。
1.测定------分子量、PI
当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。
分离范围广阔的SuperoseHR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。
用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中,可简易地测出PI,并选择纯化用缓冲液的最佳PH。
2.选择------层析方法
若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解,可尝试几种不同的纯化方法:
一]使用最通用的凝胶过滤方法,选择分离范围广阔的介质如Superose、SephacrylHR依据分子量将 样品分成不同组份。
二]用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。
亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质,再用以结合目标蛋白。
一步即可得到高纯度样品。
三]体积大的样品,往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。
高盐洗脱的样品,可再用疏水层析纯化。
疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理,洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。
两种方法常被交替使用于纯化流程中。
3.纯化------大量粗品
处理大量原液时,为避免堵塞柱子,一般使用sepharosebigbeads、sepharoseXL、sepharosefastflow等大颗粒离子交换介质。
扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质,直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。
将离心、超滤、初纯化结合为一。
提高回收率,缩短纯化周期。
4.纯化------硫酸氨样品
硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品,经处理过的样本处于高盐状态下,很适合直接上疏水层析。
若作离子交换,需先用SephadexG-25脱盐。
疏水层析是较新技术,随着介质种类不断增多,渐被融入各生产工艺中。
利用HitrapHICTestKit和RESOURCEHICTestKit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。
低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。
5.纯水-----糖类分子
固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素,可结合碳水化合物的糖类残基,很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器,纯化糖蛋白等。
两种附上外源凝集素的Sepharose6MB亲和层析介质,专为俘获整个细胞或大复合物,如膜囊等。
6.纯化------膜蛋白
膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。
离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者,避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质,籍此除去去污剂。
非离子性去污剂可以疏水层析除去。
7.纯化------单抗、抗原
*单抗多为IgG。
来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。
腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。
Mabselect、ProteinG和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用,能一步纯化各种不同源的IgG。
血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理,在培养前除去IgG。
重组蛋白A介质Mabselect和rProteinASepharoseFF对IgG有更高的载量和专一性,基团脱落更少。
脱落的rProteinA用离子交换QSepharoseHP或凝胶过滤Superdex200,很容易去除。
*疏水层析PhenylSepharoseHP亦很适合纯化IgG。
宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex200在精细纯化中去除。
*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHsactivatedSepharoseFF偶联IgG,再进一步获取IgG抗原。
*HiTrapIgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM,结合量达5mgIgM。
HiTrapIgY是专门用来纯化IgY,结合量达100mg纯IgY。
8.纯化------重组蛋白
重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。
样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物,扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。
Amershambiosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。
一]GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达,然后利用GlutathioneSepharose4B作亲和层析纯化,再利用凝血酶或因子Xa切开。
2.蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达,以IgGSepharose6FF纯化。
二]含组氨酸标记(Histidine-tagged)的融合蛋白可用ChelatingSepharoseFF螯合Ni2+金属,在一般或变性条件(8M尿素)下透过组氨酸螯合融合蛋白。
HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。
9.纯化------包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。
高化学稳定性的Superose12及Sepharose6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。
变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。
Superdex75、QSepharoseFF和PhenylSepharoseFF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。
一般包涵体蛋白样品的纯度越高,复性效果越好。
SOURCE30RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品,并可以1MnaOH重生。
此方法纯化后的包涵体蛋白,复性回收率明显提高。
10.包涵体蛋白固相复性
*近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析介质上,一般用各种SepharoseFF离子交换层析介质。
去除变性剂后,蛋白在介质上成功复性,再将复性好的蛋白洗脱下来。
固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成,所以复性得率更高,而且无需大量稀释样品,并将复性和初纯化合二为一,大大节省时间及提高回收率。
*固相复性方法也被用于以HiTrapChelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白;以HiTrapHeparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。
两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用,比一般试剂盒更方便、耐用。
11.纯化------中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。
传统中药多是煎熬后服用,有效成份多较为亲水,包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。
灵活及综合性地利用多种层析方法。
如离子交换、分子筛、反相层析,更容易分离到单一活性成分。
SephadexLH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能,例:
如用甲醇分离黄酮甙,三糖甙先被洗下来,二糖甙其次,单糖甙随后,最后是甙元。
SephadexLH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂,广泛用于各种天然产物的分离,包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。
*生物碱在酸性缓冲液中带正电,成为盐,HiTrapSP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。
相反,黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中,在HiTrapQ阴离子交换柱上分离效果良好。
*一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex,Sephacryl。
若分子量在600KD以下,并需更高分辨率,可选择新一代的Superdex。
一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。
综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。
另外,多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质,传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。
阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。
SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。
由于中药的成分非常复杂,SOURCE反相层析可用范围为PH1-14,并可用1MNaOH,1MHCL清洗、再生。
比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗,寿命也更长。
12.纯化------肽类
肽类的来源有天然萃取,合成肽和重组肽三种。
肽容易被酶降解,但可从有机溶剂或促溶剂中复性,所以多以高选择性的反相层析如SOURCE30RPC、SOURCE15RPC、SOURCE5RPC或离子交换Minibeads、Monobeads作纯化。
SuperdexPeptideHR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱,能配合反相层析做出更精美的肽图。
肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex30PG。
13.纯化------核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。
核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。
病毒也可视作核酸大分子,和质粒DNA一样,可用分离大分子的SephacryS-1000SF、Superose或Sepharoce4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白,再配合离子交换如MonoQ、SOU
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