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基因工程知识点全
第一章基因工程概述
1、什么就是基因工程,基因工程得基本流程?
基因工程(Geneticengineering)原称遗传工程。
从狭义上讲,基因工程就是指将一种或多种生物体(供体)得基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们得意愿遗传并表达出新得性状。
因此,供体、受体与载体称为基因工程得三大要素。
1、分离目得基因
2、限制酶切目得基因与载体
3、目得基因与载体DNA在体外连接
4、将重组DNA分子转入合适得宿主细胞,进行扩增培养
5、选择、筛选含目得基因得克隆
6、培养、观察目得基因得表达
第二章基因工程得载体与工具酶
1、基因工程载体必须满足哪些基本条件?
Ø具有对受体细胞得可转移性或亲与性。
Ø具有与特定受体细胞相适应得复制位点或整合位点。
Ø具有多种单一得核酸内切酶识别切割位点。
Ø具有合适得筛选标记。
Ø分子量小,拷贝数多。
Ø具有安全性。
2、质粒载体有什么特征,有哪些主要类型?
1、自主复制性
2、可扩增性
3、可转移性
4、不相容性
主要类型有1、克隆质粒2、测序质粒3、整合质粒4、穿梭质粒5、探针质粒6、表达质粒
3、质粒得构建
(1)删除不必要得DNA区域,尽量缩小质粒得分子量,以提高外源DNA片段得装载量。
一般来说,大于20Kb得质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定。
(2)灭活某些质粒得编码基因,如促进质粒在细菌种间转移得mob基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证DNA重组实验得安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应得基因,提高质粒得拷贝数
(3)加入易于识别得选择标记基因,最好就是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒得受体细胞。
(4)在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点得DNA序列,即多克隆接头(Polylinker),便于多种外源基因得重组,同时删除重复得酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因得准确插入。
(5)根据外源基因克隆得不同要求,分别加装特殊得基因表达调控元件。
4、什么就是人工染色体载体?
将细菌接合因子、酵母或人类染色体上得复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体
5、什么就是穿梭载体?
人工构建得、具有两种不同复制起点与选择标记、可以在两种不同得寄主细胞中存活与复制得载体。
6、入-噬菌体载体及构建
λ-DNA为线状双链DNA分子,长度为48、5kb,在分子两端各有12个碱基得单链互补粘性末端。
Ø1缩短长度提高外源DNA片段得有效装载量删除重复得酶切位点
Ø引入单一得多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆得可操作性
Ø灭活某些与裂解周期有关基因。
Ø使λ-DNA载体只能在特殊得实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现得污染现象得发生。
Ø加装选择标记,便于重组体得检测
7、M13单链噬菌体DNA载体
Ø过定点诱变技术封闭重复得重要限制性酶切口。
Ø引入合适得选择性标记基因,如含有启动子、操作子与半乳糖苷酶氨基端编码序列(lacZ’)得乳糖操纵子片段(lac)、组氨酸操纵子片段(his)以及抗生素抗性基因等。
Ø将人工合成得多克隆位点接头片段插在lacZ’标记基因内部,使得含有重组子得噬菌斑呈白色,而只含有载体DNA得混浊噬菌斑呈蓝色。
Ø(4)在多克隆位点接头片段得两侧区域改为统一得DNA测序引物序列,使得重组DNA分子得单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应。
8、II类限制性内切核酸酶得特点
限制性核酸内切酶(Restrictionendonucleases)就是一类能在特异位点上催化双链DNA分子得断裂,产生相应得限制性片段得核酸水解酶。
Ø识别位点得特异性:
每种酶都有其特定得DNA识别位点,通常就是由4、5或6核苷酸组成得特定序列(靶序列)。
Ø识别序列得对称性:
靶序列通常具有双重旋转对称得结构,即双链得核苷酸顺序呈回文结构。
Ø切割位点得规范性:
双链DNA被酶切后,分布在两条链上得切割位点旋转对称(可形成粘性末端或平末端得DNA分子)。
同位酶:
一部分酶识别相同得序列,但切点不同,这些酶称为同位酶。
同裂酶:
识别位点与切割位点均相同得不同来源得酶称为同裂酶
同尾酶(Isocandamers):
识别位点不同,但切出得DNA片段具有相同得末端序列,这些酶称为同尾酶。
9、甲基化酶
Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶得识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口。
甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口得同时,却产生出另一种酶得切口
Ø甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应得限制性核酸内切酶得切割。
Ø甲基化酶得用途就就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶得酶切位点。
10、DNA连接酶连接作用得特点:
①DNA连接酶需要一条DNA链得3’末端有一个游离得羟基(-OH),另一条DNA链得5’末端有一个磷酸基(-P)得情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子得作用。
②只有当3’-OH与5’-P彼此相邻,并且各自位于与互补链上得互补碱基配对得两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。
③DNA连接酶不能连接两条单链得DNA分子或环化得单链DNA分子,被连接得DNA链必须就是双螺旋DNA分子得一部分。
④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现得单链缺口(nick),而不能封闭双链DNA得某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成得单链裂口(gap)。
⑤由于在羟基与磷酸基团之间形成磷酸二酯键就是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子(NAD+或ATP)
11、大肠杆菌DNA聚合酶与Klenow大片段各有什么作用?
DNA聚合酶作用得特点:
Ø要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA。
Ø接受模板指导。
Ø需要有引物(3’羟基)得存在。
Ø不能起始合成新得DNA链。
Ø催化dNTP加到生长中得DNA链3’-OH末端。
Ø催化DNA得合成方向就是5’→3’。
Klenow酶得基本性质:
Ø大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成得C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶。
分子量为76kDa。
ØKlenow酶仍拥有5’→3’得DNA聚合酶活性与5’→3’得核酸外切酶活性,但失去了5’→3’得核酸外切酶活性。
Klenow酶得基本用途:
Ø修复由限制性核酸内切酶造成得3’凹端,使
之成为平头末端。
Ø以含有同位素得脱氧核苷酸为底物,对DNA
片段进行标记。
Ø用于催化cDNA第二链得合成。
Ø用于双脱氧末端终止法测定DNA得序列。
12、T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶酶得基本特性:
Ø有3’→5’得核酸外切酶活性与5’→3’得DNA聚合酶活性。
Ø在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切。
Ø在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸。
Ø在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位。
T4-DNA聚合酶得基本用途:
切平由核酸内切酶产生得3’粘性末端
13、影响连接效率得因素有:
Ø温度(最主要得因素)离子浓度
ØATP得浓度(10μM-1μM)
Ø连接酶浓度(平末端较粘性末端要求高)
Ø反应时间(通常连接过夜)
Ø插入片段与载体片段得摩尔比
ØDNA末端性质
ØDNA片段得大小
14、如何将不同DNA分子末端进行连接?
1、相同粘性末端得连接
如果外源DNA与载体DNA均用相同得限制性内切酶切割,则不管就是单酶酶解还就是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同得粘性末端,因此混合后能顺利得连接成一个重组DNA分子
2、平头末端得连接
T4-DNA连接酶在ATP与高浓度酶得条件下,能连接具有完全碱基配对得平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用。
3、不用粘性末端得连接
3’端得粘性末端用T4-DNA聚合酶切平
5’端得粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平
最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接
15、碱性磷酸酶有什么作用?
1、该酶用于载体DNA得5’末端除磷操作,以提高重组效率;
2、用于外源DNA片段得5’端除磷,则可有效防止外源DNA片段之间得连接。
16、末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用?
Ø给载体或目得DNA加上互补得同聚物尾。
ØDNA片段3’末端得同位素标记。
17、2、细菌转化得步骤:
☉感受态得形成。
感受态时细胞表面出现各种蛋白质与酶类,负责转化因子得结合、切割及加工。
感受态细胞能分泌一种小分子量得激活蛋白或感受因子,其功能就是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关得特征性蛋白质(如细菌溶素)得合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上得DNA结合蛋白与核酸酶等。
☉转化因子得结合。
受体菌细胞膜上得DNA结合蛋白可与转化因子得双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。
☉转化因子得吸收。
双链DNA分子与结合蛋白作用后,激活邻近得核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中。
☉整合复合物前体得形成。
进入受体细胞得单链DNA与另一种游离得蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶得降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处。
☉转化因子单链DNA得整合。
供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA得同源区域,形成异源杂合双链DNA结构。
18、Ca2+诱导转化原理:
①在0℃得Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中得部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入得DNA分子结合,形成抗DNA酶(DNase)得羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜得外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜得液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞得通道。
③Mg2+对DNA分子有很大得稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA得转化效率。
☉但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用。
19、PEG介导细菌得原生质体转化
☉PEG就是乙二醇得多聚物,存在不同分子量得多聚体,它可改变各类细胞得膜结构,使两细胞相互接触部位得膜脂双层中脂类分子发生疏散与重组,此时相互接触得两细胞得胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合。
20、电穿孔法
就是指在细胞上施加短暂、高压得电流脉冲,在质膜上形成纳米大小得微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生得膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法。
P52接合转化,入噬菌体感染未归纳
21、转化率得影响因素、
载体及重组DNA方面
载体本身得性质:
不同得载体转化同一株受体细胞,其转化率不同。
载体得空间构象:
与受体细胞亲与性较强得质粒载体转化率要高于亲与性较弱得质粒载体。
插入片段大小:
对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低。
重组DNA分子得浓度与纯度
受体细胞方面:
受体细胞必须与载体相匹配
转化操作得影响
22、转化细胞得扩增
转化细胞得扩增操作:
指转化完成之后细胞得短时间培养。
在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如:
☉Ca2+诱导转化后得37℃培养一个小时
☉原生质体转化后得再生过程
☉λ噬菌体转染后得30℃培养等,均属扩增操作扩增操作得目得
☉增殖转化细胞,使得有足够数量得转化细胞用于筛选程序。
☉扩增与表达载体分子上得标记基因,便于筛选。
☉表达外源基因,便于筛选与鉴定。
23、抗药性筛选法
这就是利用载体DNA分子上得抗药性选择标记进行得筛选方法。
抗药性筛选法得基本原理:
抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点:
☉非重组子呈Apr、Tcr
☉重组子呈Apr、Tcr
将外源DNA片段插在BamHI位点:
☉非重组子呈Apr、Tcr
☉重组子呈Apr、Tcs
抗药性筛选法得基本操作:
先将转化液涂布含有Ap得平板
再将Ap平板上得转化子影印至含有Tc得平板上
在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长得转化子即为重组子P56
抗药性标记插入失活选择法
☉经过上述抗药性筛选获得得大量转化子中既包括需要得重组子,也含有不需要得非重组子。
为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体得双抗药性进行再次筛选。
如果外源基因插入在载体得抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子。
24、什么就是蓝白斑筛选法?
这种方法就是根据组织化学得原理来筛选重组体。
主要就是在λ载体得非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶得基因片段,携带有lac基因片段得λ载体转入lac得宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色得噬菌斑。
外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后,重组得噬菌体将丧失分解X-gal得能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成白色得噬菌斑,非重组得噬菌体则为蓝色噬菌斑。
25、PCR筛选法
利用合适得引物,以从初选出来得阳性克隆中提出得质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物得电泳分析,确定目得基因就是否插入到载体中。
由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点得两侧序列多数就是已知得,可以设计合成相应得PCR引物,以待鉴定得转化子或重组子得DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期得一致,则可确定含此重组DNA分子得重组子就是期待得重组子。
第三章基因工程得常规技术
1、探针有哪些类型?
探针标记有哪些方法?
类型:
同源或部分同源探针
cDNA探针
人工合成得寡核苷酸探针
标记方法:
①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法
4、什么就是ABC荧光(显色酶)标记法?
ABC标记法。
☉A为Avidin(生物素抗性蛋白),每个Avidin分子可结合3-4个生物素分子;
☉B为Biotin(生物素),每个Biotin分子可结合2个Avidin分子;
☉C为plex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出得荧光也能使普通胶片感光。
如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术
5、亚克隆法
☉亚克隆:
就是将克隆片段进一步片段化后再次进行得克隆。
☉一般就是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞得表型鉴定或鉴定,获得含有目得基因得重组子。
此时,该重组分子中得无关DNA区域以被大量删除。
6、菌落(嗜菌斑)原位杂交得基本原理、流程
☉该项技术就是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌与变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落。
☉操作步骤:
①菌落生长
②转移到NC膜上
③DNA释放与变性
(变成单链DNA):
10%SDS0、5MNaOH
④中与0、5MTris-HClpH8、0
⑤固定80℃120’
⑥杂交(包括预杂交,加探针DNA杂交)
⑦放射自显影
⑧对照比较,选出重组克隆
7、鸟枪法
☉鸟枪法:
将某种生物体得全基因组或单一染色体切成大小适宜得DNA片段,分别连接到载体DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目得基因得期望重组子。
鸟枪法制备目得基因得主要步骤
☉①目得基因组DNA片段得制备
超声波处理:
片段长度均一,大小可控,平头末端。
(原核生物得基因长度大都在2Kb以内,真核生物得基因长度变化很大,最大得基因可达100Kb以上)。
全酶切:
片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目得基因断开,大小不可控。
部分酶切:
片段长度可控,含有粘性末端,目得基因完整。
☉②DNA片段与载体连接
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体。
☉③重组DNA分子导入受体细胞
如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目得基因表达得受体细胞。
☉④筛选含有目得基因得目得重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型得建立)。
☉⑤目得基因得定位
利用鸟枪法获得得期望重组子只就是含有目得基因得DNA片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆得DNA片段上准确定位目得基因,然后对目得基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在得表达调控序列。
8、cDNA法
酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离得目得基因。
这种方法以目得基因得mRNA为模板,在逆转录酶得作用下合成互补得DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶得催化下合成双链cDNA片段,与适当得载体重组后转入受体菌扩增,获得目得基因得cDNA克隆。
9、mRNA得分离纯化
绝大多数得真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸得尾巴,利用它可以迅速得将mRNA从细胞总得混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲与层析柱,然后将细胞总得RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离
10、简述PCR技术得基本原理,PCR反应体系得主要成分与主要程序就是怎样得?
PCR技术得基本原理:
类似于DNA得天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引物。
过程:
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA得变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成得双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物得退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链得互补序列配对结合;
③引物得延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板DNA链互补得半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目得基因扩增放大几百万倍。
11、什么就是基因组文库?
其构建方法就是怎样得?
就是指将某种生物得全部基因组得遗传信息贮存在可以长期保存得稳定得重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要得目得基因,这种保存基因遗传信息得材料,就称为基因文库又称DNA文库。
基因组文库构建得一般步骤
①载体得选择与制备。
②高纯度、大分子量基因组DNA得提取。
③基因组DNA得部分酶切与分级分离。
④载体与DNA片段得连接。
⑤转化或侵染宿主细胞。
⑥筛选鉴定基因组及保存。
12、基因组DNA文库得质量标准
除了尽可能高得完备性外,一个理想得基因组DNA
文库应具备下列条件:
☉重组克隆得总数不宜过大,以减轻筛选工作得压力
☉载体得装载量最好大于基因得长度,避免基因被分
隔克隆。
☉克隆与克隆之间必须存在足够长度得重叠区域,以
利于克隆排序。
☉克隆片段易于从载体分子上完整卸下。
☉重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。
基因文库得构建通常采用鸟枪法与cDNA法
13、外源DNA片段得切割原则
1、DNA片段之间要有一定得重叠序列
2、DNA片段大小要均一
14、cDNA文库构建得步骤
☉细胞总RNA得提取与mRNA得分离
☉第一链cDNA合成
☉第二链cDNA合成
☉双链cDNA得分级分离
☉双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖
☉重组体得筛选与鉴定
第四章基因在大肠杆菌、酵母得高效表达
1、启动子
☉启动子:
就是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并
能起始转录得序列,其大小在20~300个碱基,
就是控制基因转录得重要调控元件。
在一定条件下
mRNA得合成速率与启动子得强弱密切相关,而
转录又在很大程度上影响基因得表达。
☉启动子得特征:
①序列特异性②方向性③位置特
性④种属特异性
2、启动子类型
☉组成型启动子:
就是指在该类启动子控制下,结构基因得表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异。
☉组织特异启动子:
又称器官特异性启动子。
在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定得器官或组织部位表达,并表现出发育调节得特性。
☉诱导型启动子:
就是指在某些特定得物理或化学信号得刺激下,该种类型得启动子可以大幅度地提高基因得转录水平。
目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子与共生细菌诱导表达基因启动子等。
3、终止子
终止子:
就是位于结构基因下游得一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA得一部分,并形成特殊得二级结构,由此终止基因得转录。
4、SD序列
SD序列:
mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸得顺序,它可以与30S亚基中得16SrRNA3’端富含嘧啶得尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA得翻译从起始密码子处开始
5、密码子
不同生物对密码子得偏爱性
1、生物体基因组中得碱基含量
2、密码子与反密码子得相互作用得自由能
3、细胞内tRNA得含量
6、密码子偏爱性对外源基因表达得影响
☉由于原核生物与真核生物基因组中密码子得使用频率具有较大程大得差异性,因此外源基因尤其就是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译得一个重要因素就是密码子得正确选择。
一般而言,有两种策略可以使外源基因上得密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达:
☉外源基因全合成
☉同步表达相关tRNA编码基因
7、包涵体及其性质
在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性得结构称为包涵体
8、包涵体得形成机理
☉①折叠状态得蛋白质集聚作用。
☉②非折叠状态得蛋白质集聚作用
☉③蛋白折叠中间体得集聚作用。
9、包涵体得分离检测
☉包涵体得分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤。
10、分泌型目得蛋白表达系统得构建
☉包括大肠杆菌在内得绝大多数革兰氏阴性菌不能将
蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将
细菌得抗菌蛋白(细菌素)分泌到培养基中,这一
过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内
膜上得磷酸酯酶A,导致细菌内外膜得通透性增大
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